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【导读】将待检测的DNA分子用/不用限制性内切酶消化后，通过琼脂糖凝胶电泳进行分离，继而将其变性并按其在凝胶中的位置转移到硝酸纤维素薄膜或尼龙膜上，固定后再与同位素或其它标记物......
将待检测的DNA分子用/不用限制性内切酶消化后，通过琼脂糖凝胶电泳进行分离，继而将其变性并按其在凝胶中的位置转移到硝酸纤维素薄膜或尼龙膜上，固定后再与同位素或其它标记物标记的DNA或RNA探针进行反应。如果待检物中含有与探针互补的序列，则二者通过碱基互补的原理进行结合，游离探针洗涤后用自显影或其它合适的技术进行检测，从而显示出待检的片段及其相对大小。
用途：检测样品中的DNA及其含量，了解基因的状态, 如是否有点突变、扩增重排等。
试剂和器材
变性液：1.5mol/L NaCl，0.5mol/L NaOH。
中和液：0.5mol/L Tris-HCl (pH=7.0)，1.5mol/L NaCl。
20&SSC：3mol/L NaCl，0.3mol/L 柠檬酸钠。
以上溶液均在100Kpa灭菌20分钟。
2&SSC：用无菌移液管吸取20&SSC溶液5mL，加无菌水45mL。
6&SSC：用无菌移液管吸取20&SSC溶液15mL，加无菌水75mL。
22cm&15cm瓷盘
1. 在琼脂糖凝胶上电泳分离DNA。取出凝胶，切去边缘多于部分，EB染色，在紫外灯下照相（放一标尺，可从像片中读出DNA迁移的距离）。
2. 将凝胶置于200mL变性液中，浸泡45分钟，并温和地不断振荡，使凝胶上的ds-DNA转变为ss-DNA，然后用重蒸水冲洗凝胶几次。
3. 用中和液浸泡凝胶并不断地振荡45分钟，将凝胶中和至中性。防止凝胶的碱性破坏硝酸纤维膜。
4. 取一个瓷盘，在底部放一块玻璃板（或一块海绵）使盛器内的20倍SSC转移滤液低于玻板表面，在玻板表面盖一张3mm的二号滤纸，滤纸两边浸没于20倍SSC溶液中，在玻璃和滤纸之间，赶掉所有的气泡。
5. 把凝胶底面朝上放在滤纸上，赶走两层之间出现的气泡。
6. 裁剪一张硝酸纤维膜，其长与宽大于凝胶1―2mm，并在角上作记号，以确定滤膜方位。先把它放在去离子水中润湿后，再放在20倍SSC溶液中润湿5分钟，然后放在凝胶表面，两层之间不可有气泡。
7. 然后再把两张与滤膜一样大小的二号滤纸，在2倍SSC溶液中浸湿，覆盖在硝酸纤维膜上，同样要把气泡赶走。
8. 把一叠吸水纸（或卫生纸，约有5―8cm高，略小于滤纸），放置在滤纸上，在吸水纸上再放一块玻璃板和重约500g的重物，放置过夜。
9.转移结束后，移去上面的吸水纸和滤纸，同时翻转取出凝胶与硝酸纤维膜，把凝胶的点样与硝酸纤维膜的相对应位置用铅笔或解剖针的针尖做好标记。
11. 把已转移了DNA的硝酸纤维膜放在6倍SSC溶液中振荡浸泡5分钟，然后放在滤纸上吸干溶液。再把它夹在两层滤纸之间，80℃真空干燥2小时。
（1）将凝胶中和至中性时，要测pH, 防止凝胶的碱性破坏硝酸纤维膜。
(2) 要注意赶走凝胶和滤纸及硝酸纤维素膜之间的气泡。
Southern 杂交简介：
Southern 杂交是分子生物学的经典实验方法,屏风。其基本原理是将待检测的DNA样品固定在固相载体上，与标记的核酸探针进行杂交，在与探针有同源序列的固相DNA的位置上显示出杂交信号。通过Southern杂交可以判断被检测的DNA样品中是否有与探针同源的片段以及该片段的长度。该项技术广泛被应用在遗传病检测、DNA指纹分析和PCR产物判断等研究中。但由于该技术的操作比较烦琐、费时，所以现在有一些其他的方法可以代替Southern 杂交。但该技术也有它的独特之处，是目前其他方法所不能替代的，如限制性酶切片段的多态性(RFLP)的检测等。
一、基因组DNA的制备
二、基因组DNA的限制酶切
　　根据实验目的决定酶切DNA的量。一般Southern杂交每一个电泳通道需要10-30&g的DNA。购买的限制性内切酶都附有相对应的10倍浓度缓冲液，并可从该公司的产品目录上查到最佳消化温度。为保证消化完全，一般用2-4U的酶消化1&g 的DNA。消化的DNA浓度不宜太高，以0.5&g /&l 为好。由于内切酶是保存在50%甘油内的，而酶只有在甘油浓度&5%的条件下才能发挥正常作用，所以加入反应体系的酶体积不能超过1/10。
具体操作如下：在1.5ml离心管中依次加入
DNA（1&g /&l） 20 &g
10&酶切buffer 4.0 &l
限制性内切酶（10U/&l） 5.0 &l
加ddH2O 至 500 &l
在最适温度下消化1-3hr。消化结束时可取5&l电泳检测消化效果。如果消化效果不好,棉纱，可以延长消化时间，但超过6hr已没有必要。或者放大反应体积，或者补充酶再消化。如仍不能奏效，可能的原因是DNA样品中有太多的杂质，或酶的活力下降。
消化后的DNA加入1/10 体积的0.5M EDTA，以终止消化。然后用等体积酚抽提、等体积氯仿抽提，2.5倍体积乙醇沉淀，少量TE溶解（参见DNA提取方法，但离心转速要提高到12000g，以防止小片段DNA的丢失）。
如果需要两种酶消化DNA，而两种酶的反应条件可以一致，则两种酶可同时进行消化；如果反应条件不一致，则先用需要低离子强度的酶消化，然后补加盐类等物质调高反应体系的离子强度，再加第二种酶进行消化。
三、基因组DNA消化产物的琼脂糖凝胶电泳
琼脂糖凝胶电泳是目前分离核酸片段最常用的方法，制备简单，分离范围广（200bp-50kb），实验成本低。下表列举了不同浓度琼脂糖凝胶能分离的DN*段范围。
表：不同浓度琼脂糖凝胶分离DN*段的范围
琼脂糖凝胶浓度（%）分离DN*段范围（kb） 0.3 5-60 0.6 1-20 0.7 0.8-10 0.9 0.5-7 1.2 0.4-6 1.5 0.2-3 2.0 0.1-2 1. 制备0.8%凝胶：一般用于Southern杂交的电泳胶取0.8%。
2. 电泳：电泳样品中加入6&Loading 缓冲液，混匀后上样，留一或两泳道加DNA Marker。1-2V/cm，DNA从负极泳向正极。电泳至溴酚蓝指示剂接近凝胶另一端时，停止电泳。取出凝胶，紫外灯下观察电泳效果。在胶的一边放置一把刻度尺，拍摄照片。正常电泳图谱呈现一连续的涂抹带，照片摄入刻度尺是为了以后判断信号带的位置，以确定被杂交的DNA长度。
四、DNA从琼脂糖凝胶转移到固相支持物
转移就是将琼脂糖凝胶中的DNA 转移到硝酸纤维膜（NC膜）或尼龙膜上，形成固相DNA。转移的目的是使固相DNA与液相的探针进行杂交。常用的转移方法有盐桥法、真空法和电转移法。这里介绍经典的盐桥法（又称为毛细管法）。
（一）试剂准备
１．变性液：0.5M NaOH；1.5 M NaCl。
２．中和液：1M Tris-HCl(pH 7.4)；1.5M NaCl;
３．转移液（20&SSC）： NaCl 175.3g; 柠檬酸三钠82.2g，NaOH 调pH 至7.0，加ddH2O至1000ml。
（二）操作步骤
1.碱变性:室温下将凝胶浸入数倍体积的变性液中30min。
2.中和:将凝胶转移到中和液15min。
3．转移按凝胶的大小剪裁NC膜或尼龙膜并剪去一角作为标记，水浸湿后，浸入转移液中5min。剪一张比膜稍宽的长条Whatman 3mm滤纸作为盐桥，再按凝胶的尺寸剪3-5张滤纸和大量的纸巾备用。按下图所示进行转移。（转移过程一般需要8-24hr，每隔数hr换掉已经湿掉的纸巾。转移液用20&SSC。注意在膜与胶之间不能有气泡。整个操作过程中要防止膜上沾染其他污物。）
4. 转移结束后取出NC膜，浸入6&SSC溶液数min，洗去膜上沾染的凝胶颗粒，置于两张滤纸之间，80&C烘2hr，然后将NC膜夹在两层滤纸间，保存于干燥处。
五、探针标记
进行Southern 杂交的探针一般用放射性物质标记或用地高辛标记。放射性标记灵敏度高，效果好；地高辛标记没有半衰期，安全性好。这里介绍放射性标记。
探针的标记方法有随机引物法、切口平移法和末端标记法，有一些试剂盒可供选择，操作也很简单。
以下为Promega公司随机引物试剂盒提供的标记步骤：
1．取25-50ng模板DNA于0.5ml离心管中，100℃变性5min，立即置冰浴。
2．在另一个0.5ml离心管中加入：
Labeling 5&buffer 10&l
（含有随机引物）
dNTPmix 2&l
(含 dCTP、dGTP、dTTP 各 0.5mM)
BSA（小牛血清白蛋白） 2&l
[a-32P]dATP 3&l
Klenow酶 5U
3．将变性模板DNA加入到上管中，加ddH2O至50&l，混匀。室温或37℃ 1hr。
4．加50&l 终止缓冲液终止反应。
标记后的探针可以直接使用或过柱纯化后使用。由于a-32P的半衰期只有14天，所以标记好的探针应尽快使用。探针的比活性最好大于109计数/分/&l。
Southern 杂交一般采取的是液-固杂交方式，即探针为液相，被杂交DNA为固相。杂交发生于一定条件的溶液（杂交液）中并需要一定的温度,滤纸，可以用杂交瓶或杂交袋并使液体不断的在膜上流动。杂交液可以自制或从公司购买，不同的杂交液配方相差较大，杂交温度也不同。下面给出的为一杂交液配方：
PEG 6000 10%；SDS 0.5%；6&SSC；50%甲酰胺。该杂交液的杂交温度为42℃。
NC膜浸入2&SSC中5min，在杂交瓶中加入杂交液（8cm&8 cm的膜加5ml即可），将膜的背面贴紧杂交瓶壁，正面朝向杂交液。放入42℃杂交炉中，使杂交体系升到42℃。取经超声粉碎的鲑鱼精DNA（已溶解在水或TE中）100℃加热变性5min，迅速加到杂交瓶中，使其浓度达到100&g/ml。继续杂交4hr。鲑鱼精DNA的作用是封闭NC膜上没有DNA转移的位点，降低杂交背景、提高杂交特异性。
倒出预杂交的杂交液，换入等量新的已升温至42℃的杂交液，同样加入变性的鲑鱼精DNA。将探针100℃加热5min，使其变性，迅速加到杂交瓶中。42℃杂交过夜。
七、洗膜与检测
取出NC膜，在2&SSC溶液中漂洗5min，然后按照下列条件洗膜：
2&SSC/0.1% SDS，42℃，10min；
1&SSC/0.1% SDS，42℃，10min；
0.5&SSC/0.1% SDS，42℃，10min；
0.2&SSC/0.1% SDS，56℃，10min；
0.1&SSC/0.1% SDS，56℃，10min。
在洗膜的过程中，不断振摇，不断用放射性检测仪探测膜上的放射强度。实践证明，当放射强度指示数值较环境背景高1-2倍时，是洗膜的终止点。上述洗膜过程无论在哪一步达到终点，都必须停止洗膜。洗完的膜浸入2&SSC中2min，取出膜，用滤纸吸干膜表面的水份，并用保鲜膜包裹，注意保鲜膜与NC膜之间不能有气泡。将膜正面向上，放入暗盒中（加双侧增感屏），在暗室的红光下，贴覆两张X光片，每一片都用透明胶带固定，合上暗盒，置-70℃低温冰箱中曝光。根据信号强弱决定曝光时间，一般在1-3天时间。洗片时，先洗一张X光片，若感光偏弱，则再多加两天曝光时间，再洗第二张片子。
影响Southern杂交实验的因素很多，主要有：DNA纯度、酶切效率、电泳分离效果、转移效率、探针比活性和洗膜终止点等。
七、注意事项
1. 要取得好的转移和杂交效果，应根据DNA 分子的大小，适当调整变性时间。对于分子量较大的DN*段（大于15kb），可在变性前用0.2M HCl预处理10min使其脱嘌呤。
2. 转移用的NC膜要预先在双蒸水中浸泡使其湿透，否则会影响转膜效果；不可用手触摸NC膜，否则影响DNA的转移及与膜的结合。
3. 转移时，凝胶的四周用Parafilm蜡膜封严，防止在转移过程中产生短路，影响转移效率，同时注意NC膜与凝胶及滤纸间不能留有气泡，以免影响转移。
4. 注意同位素的安全使用。
基因组DNA Southern杂交
1）基因组DNA Southern印迹的制备
1．用适当的限制性内切酶消化基因组DNA样品（10&g）。
2．进行琼脂糖凝胶电泳。一般用0.7～1.0％的琼脂糖凝胶分离基因组DNA，它在1～15kb的范围内有较好的分辨率，可选用TBE或TAE缓冲液。琼脂糖凝胶电泳需在1V/cm的电压下进行，如果要分离片段大小相似的DNA带，应用较大的凝胶（20&25cm）。常用的标准品是由Hind Ⅲ消化的&DNA、Hae Ⅲ消化的&PX174 DNA和100或1000bp的梯形图谱。电泳完毕，将凝胶放在紫外透射仪上，并在凝胶旁放一尺子进行拍照。当把凝胶从盘内移动紫外透射仪时，小心不要将凝胶滑落或弄破。
Southern印迹的制备
1．将凝胶转移至塑料盒内。
2．加入至少4倍凝胶体积的0.25mol/L HCl使DNA脱嘌呤，置室温摇床温育15min。这时凝胶上样缓冲液中的溴酚蓝应变黄色，如果15min后仍呈蓝色，应再温育5min。
3．小心地塑料盒内HCl弃去，用蒸馏水漂洗凝胶一次。
4．加入至少4倍体积的变性缓冲液，置室温摇床温育20min。
5．用新鲜缓冲液重复步骤4，小心弃去变性缓冲液，用蒸馏水稍加漂洗。
6．加入至少4倍体积的中和反应缓冲液，置室温摇床温育15min。
7．用新鲜缓冲液重复步骤6。
8．当处理凝胶时，裁一张略大于凝胶的滤膜（硝酸纤维膜或尼龙膜），预先用蒸馏水将滤膜浸湿后用20&SSC浸泡至少15min。
9．安装转移装置。在盘中加入印迹缓冲液（20&SSC），在缓冲液面作一平台，比如可倒置一凝胶盘，上面盖三张经20&SSC饱和过的滤纸（Whatman 3MM），平台两侧的滤纸应浸泡在缓冲液中，用10ml的玻璃吸管在其表面小心滚动以赶出所有气泡，并将滤纸推平。
10．倒数毫升20&SSC于滤纸表面，将凝胶面向下倒扣在滤纸上，小心赶出凝胶与滤纸间的气泡，凝胶四周用胶布或塑料薄膜包裹以防缓冲液从凝胶周围直接流至纸中（虹吸短路）。
11．加数ml 20&SSC浸没凝胶，表面覆以滤膜，确保凝胶与滤膜之间无气泡。
12．裁三张大小合适的3MM滤纸，用20&SSC浸湿后铺在滤膜表面。
13．放一叠干燥的吸水纸（印迹纸或纸巾）在3MM滤纸上（约5～8cm高）。
14．置一玻璃板于吸水纸上，其上放一重约0.75～1kg的物体。
15．DNA转移可进行12～16h（如过夜），确保槽内有足够的20&SSC（1～3L）。
16．毛细管虹吸转移完毕，小心拆卸印迹装置。将膜与凝胶一起转移至干燥的滤纸上，凝胶在上，用软铅笔标记凝胶和滤膜的加样孔位置，撕去凝胶。
17．用5&SSC漂洗杂交膜以去除琼脂糖残迹。
18．将滤膜放在一张干燥的3MM滤纸上稍微晾干。
19．固定DNA于滤膜上，若用硝酸纤维素膜，在80℃真空箱中烤2h；若用尼龙膜，将DNA面朝下暴露于紫外透射仪3～5min。
20．这时的滤膜已可用于杂交，或贮存在4℃。硝酸纤维素膜需真空保存，尼龙膜需用塑料薄膜密封。
2）DNA印迹杂交
1．用5&SSPE浸渗DNA滤膜。
2．将浸湿的DNA滤膜放入塑料袋内，袋的四边密封并剪去一角。
3．从缺口处加入预杂交液（0.1ml/cm2），避免加入气泡，将袋中的气泡全部挤出，封口。
4．将塑料袋置水浴摇床中温育，或夹在两块玻璃板中置65℃烤箱2～4小时，确保滤膜表面无气泡。
5．在95℃ 10min使探针变性，立即置冰浴冷却5min。
6．剪去杂交袋的一角，将预杂交液倒入15或50ml的Falcon试管中，将约10～20ng/ml（随机引物标记的）或50～100ng/ml（缺口平移法的）探针加到预杂交液或新鲜配制的杂交缓冲液中（如果打算用硫酸葡聚糖）。一般来说，106～107cpm/ml已足够，轻轻混匀，用一次性的塑料移液管将杂交液加到塑料袋内的滤膜上。
7．从开角处将杂交液袋内的气泡全部挤出，用纸巾吸去流出的少许杂交液，小心封口以防杂交液漏出。必要的话，可将此杂交袋套在另一塑料袋中以防放射性污染。
8．在65℃水浴摇床中温育或夹在两块玻璃板中置烤箱烘烤12～16h。
9．杂交后，剪去杂交袋的一角，挤出杂交混合液倒入15或50ml的Falcon管中，小心不要使放射性溶液溅出。
10．将杂交袋完全打开，用钝头镊子将滤膜转移至盘内以便漂洗，立即用缓冲液1（2&SSC，0.1％SDS）洗滤膜。
11．室温下，用漂洗缓冲液1漂洗滤膜三次，每次5min。
12．室温下，用漂洗缓冲液2（0.25&SSC，0.1％SDS）漂洗滤膜两次，每次5min。
13．在65℃用预热的漂洗缓冲液2洗膜1～3次，每次15min。在更换缓冲液之间，应用盖革计数器检测滞留在印迹中心的放射性（将印迹中心所期望的特异性信号与印迹边缘所期望的本底信号相比较）。
14．充分漂洗后，将滤膜放在一张3MM的滤纸上稍微晾干，将潮湿的滤膜封在薄塑料袋内或用塑料薄膜包裹。
15．滤膜的放射自显影：将印迹膜（封在塑料袋内，DNA面朝上）放在X射线暗盒底部，其上放置（摄影的）胶片，增感屏常规贴在盒盖内面，关闭暗盒，在－70℃进行放射自显影过夜～两周。
(来源:未知)
(责任编辑：林溪)
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Southern杂交（地高辛法）背景很高很难看怎么办？
最近采用地高辛标记和检测试剂盒（DIG High Prime DNA Labeling and Detection Starter KitⅠ）做Southern杂交背景总是很难看(之前做点杂交也是如此问题,见下图)，请各位战友帮忙看看可能是什么原因造成这样的结果？如何改进？先谢谢大家的帮助！
我的杂交方法：
1 杂交探针的制备
⑴&&PCR扩增
目的基因的引物序列、PCR扩增反应条件、PCR扩增反应体系略
⑵&&PCR扩增产物的纯化与回收
采用小量胶回收试剂盒
⑶&&探针标记（随机引物法）
1.&&取回收纯化的目的基因扩增产物（待标探针）1μg加无菌蒸馏水定容至16ul。
2.&&沸水10 min（使DNA变性），快速置碎冰上冷却。
3.&&混匀DIG-High Prime（vial1），取4μl到变性的DNA，混匀并稍离心，37℃反应20h。
4.&&加2ul0.2mol/lEDTA（pH8.0）终止反应，-20℃保存备用。
2 基因组DNA酶切
基因组DNA酶切，使用NEB内切酶。
按下表（略）配制酶切反应体系，于37℃水浴中酶切。
3 印迹（高盐转移法）
⑴&&凝胶处理
电泳、变性、中和。
1.&&取一方盘，方盘内加入适量的20×SSC溶液。
2.&&方盘上架一块玻璃板，玻璃板上铺一张清洁的Whatman 3MM滤纸，滤纸两端浸没在20×SSC溶液中，滤纸与玻璃板之间不得有气泡
3.&&取出中和后的凝胶，倒扣（点样孔向下）于Whatman 3MM滤纸上，用玻璃棒滚动去处胶与滤纸之间的气泡。
4.&&剪一块与胶大小相同的尼龙膜（带正电荷），放在无菌超蒸水表面，使之自然吸水下沉。
5.&&将膜转入20×SSC溶液中浸泡5min。
6.&&将湿润的膜准确的盖在凝胶上面，膜与凝胶接触后，不在移动。
7.&&将两张与膜大小相同的Whatman 3MM滤纸置2×SSC溶液中湿润，盖在膜上，排除气泡。
8.&&滤纸上放一叠与膜大小相同的吸水纸（高8～10cm），吸水纸上放一块大小适宜的玻璃板，玻璃板上压0.5～1kg的重物，水平放置，转移18h。
9.&&取下吸水纸及滤纸，接去胶。将尼龙膜于6×SSC溶液中浸泡5min，置滤纸上吸干。
10. DNA印迹面向上，将膜置于Ultraviolet Crosslinker 1,500微焦/厘米2 1min。
变性液:&&1.5mol/lNaCl，0.5mol/lNaOH
中和液:&&1mol/lTris•Cl(pH8.0), 1.5mol/lNaCl
20×SSC: 3mol/lNaCl，0.3mol/l柠檬酸钠 (pH7.0)
2×SSC:&&0.3mol/lNaCl，0.03mol/l柠檬酸钠 (pH7.0)
4 预杂交与杂交
1.&&预热（42℃）一定体积的地高辛预杂交液(DIG Easy Hyb)(10ml/100cm2膜)，加尼龙膜于装有预杂交液的杂交管中，放入杂交炉温度42℃，预杂交2h。
2.&&标记DNA探针（25ng/ml DIG Easy Hyb）煮沸5min，立即置于冰上冷却，使其变性。
3． 加变性的标记DNA探针于预热地高辛预杂交液中，混合不产生泡沫（防止产生背景）。
4.&&将尼龙膜放入含有探针的杂交液中，放入杂交炉，温度42℃，培养过夜（23～24h）。
5 洗膜与显影
1.&&杂交结束后，取出杂交膜，迅速置含有洗膜液Ⅰ（预热到68℃）的杂交管中，68℃洗膜2次，各15min；再用洗膜液于68℃最大转速洗膜2次，各15min。
2.&&将尼龙膜从杂交管中取出，放入平皿中，室温下，在washing buffer中浸泡5min。
3.&&将尼龙膜放入含有100ml 新配制的1×Blocking solution的杂交管中浸泡60min，室温下进行。
4.&&膜放入含有10mlAntibody solution杂交管中浸泡40min，室温下进行。
5.&&用充足的washing buffer杂交管中最大转速室温洗膜2次，各15min。
6.&&将膜放入20mlDetection buffer中平衡2～5min。
7.&&将膜DNA面朝上放在培养皿上，加1ml底物液（20μl NBT/BCIP加入1ml Detection buffer中/bottle5），避光显色5～1h。
8.&&照相。
洗膜液Ⅰ：2×SSC，0.1%SDS
洗膜液Ⅱ：0.5×SSC，0.1%SDS
Washing buffer：0.1mol/lMaleic acid，0.15mol/lNaCl；pH7.5；0.3%(v/v)Tween20
Maleic acid buffer：0.1mol/lMaleic acid，0.15mol/lNaCl；用固体NaOH调节pH7.5
Detection buffer：0.1mol/lTris•Cl，0.1mol/lNaCl，pH9.5
1×Blocking solution：10×Blocking solution(vial6)用Maleic acid buffer稀释10倍（现用现配）
Antibody solution：每次用之前，10000 rpm离心Anti-Digoxigenin-AP(vial4) 5min,小心从表面吸取所需剂量，用1×Blocking solution按1: mU/ml)稀释Anti-Digoxigenin-AP。2-8℃可稳定保存12h。
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& Southern杂交
Southern杂交
（一）所谓DNA探针，实际上是一段已知序列的基因片段，应用这一基因片段即可与待测样品杂交。如果靶基因和探针的核苷酸序列互补，就可按碱基配对原则进行核酸分子杂交，从而达到检测样品基因的目的。在随机引物法标记的反应液中，有随机合成的六聚核苷酸作为引物，dATP、dCTP、dGTP、dTTP和D1G-11-dUTP作为合成底物，以单链DNA作为模板，在Klenow酶的作用下，合成插入地高辛的DNA链。以地高辛标记的探针与靶基因DNA链杂交后，再通过免疫反应进行检测。通过酶标记地高辛抗体检测，可以肯定杂交反应存在。
免疫检验一般用碱性磷酸酶系统，BClP/NBT显色。敏感性很高。可用于膜上杂交和原位杂交。&
（二）核酸探针膜上杂交原理
1、杂交总原则
脱氧核苷酸通过磷酸二酯键缩合成长链构成DNA一级结构。两条碱基互补的多核苷酸链按碱基配对原则形成双螺旋，构成DNA的二级结构。某些条件（如酸碱,有机溶剂，加热）可使轻键断裂，DNA双链打开成单链重新结合。所谓杂交，是具有一定互补序列的核酸单链，DNA单链仍然可与序列同源的单链按碱基互补的原则结合成异源性双链的过程。&
2、杂交膜的选择
杂交膜可以选择硝酸纤维素和尼龙膜。硝酸纤维素膜的优点在于本底较低，但只能用于显色性检测，且不能用于重复杂交。尼龙膜分为带正电的膜和不带电的膜两种。带正电的膜对核酸结合力强，敏感性也高。不带电的结合力低。敏感性差。尼龙膜的优点在于杂交用过的膜，用洗脱液（0.1xSSC,0.1%SDS）煮沸5-10min后去探针，可用于新的探针杂交。如果对杂交结果不满意，如背景太高或显色不强，也可洗去探针之后重新杂交。&
3、预杂交和杂交液
预杂交和杂交都使用相同缓冲液，不同的仅是预杂交液中不含探针。
下面是几种基本的杂交液配方：
（1）Standard buffer: 5Xssc,0.1%(w/v) N-Lauroylsarcosine,0.02%(w/v)SDS,1%&Blocking Reagent.
（2）Standard buffer 50% formamide:50% formamide(deionized),5Xssc,0.1%(W/V)&N-lauroy lsarcosine.0.02 (w/v)SDS,2%Blocking Reagent.
（3）High SDS buffer(church buffer): 7%SDS,50% formamide(deionized),&5Xssc, 2% Blocking Reagent,50Mm Sodium phosphate,0.1% N-Lauroylsarcosine.
4、Southern &Blotting
DNA片段经电泳分离后按分子量大小排列在琼脂糖凝胶上。1975年Southern发明了利用浓盐溶液的推动作用将变性的单链DNA转移到硝酸纤维素膜上的方法，解决了原位转移的问题。虽然其原理和操纵均很简单，却是基因分析中必不可少的手段，已经得到了广泛的应用。&
& Southern 印迹杂交包括两个步骤：
（1）把电泳分级的DNA转移到固定支持膜上。
(2) 与标记的DNA探针杂交。
（1）Standard buffer: 5Xssc,0.1%(w/v) N-Lauroylsarcosine,0.02%(w/v)SDS,1%Blocking Reagent.
（2）Standard buffer 50% formamide:50% formamide(deionized),5Xssc,0.1%(W/V)N-lauroy lsarcosine.0.02% (w/v)SDS,2%Blocking Reagent.
（3）High SDS buffer(church buffer): 7%SDS,50% formamide(deionized),&5Xssc, 2% Blocking Reagent,50Mm Sodium phosphate,0.1% N-Lauroylsarcosine.
一、探针的标记
1、用灭菌去离子蒸馏水稀释1&gDNA至总体积16&l.。
2、DNA热变性：把DNA置于沸水中水浴10min。然后迅速插入碎冰中3min以上。
3、加4&l DIG Random Labeling Mix(高效)，混匀后再离心2000rmp &5min。
4、置于37℃反应至少2 h 。时间越长,标记探针的产量越高。延长反应时间至20 h可明显增加地高辛标记DNA的产量。应根据需要控制反应时间。
5、加入2&l EDTA以终止反应，对于原位杂交和膜反应杂交来说，标记反应可告结束，上述反应液置于-20℃保存至少一年以上。且可反复使用。&
二、Soutern转移
首先讲DNA用限制性内切酶消化。准备一定浓度的琼脂糖凝胶必须是高纯度和核酸级的。电泳后经溴化乙锭染色并在紫外灯下照相后，将需要转移的琼脂糖凝胶切下，放入搪瓷盘中，然后进行下面的步骤。
（一）试剂
1、0.25 M HCL
2、变性液：0.5N NaoH,1.5M NaCL
3、中和度： 0.5M Tris-HCl,Ph7.4,3M NaCl
4、20 x SSC: 0.3M 柠檬酸钠，3M NaCl
5、2 x SSC: 0.03M 柠檬酸钠，0.3M NaCl&
（二）程序：
1、将凝胶浸入0.25M HCl 中10 min。HCl处理的作用主要是通过嘌呤使DNA分子断裂，因而有利于高分子量DNA的转移，但不能处理时间过长。要转移全部小于10kb的DNA片段时可省略次步骤。
2、进入变性液之前，用蒸馏水漂洗20-30 min。
3、把凝胶浸入变性液中，室温浸泡15min&2次。
4、蒸馏水漂洗凝胶2次。
5、把凝胶浸入中和液中，室温泡15min &2次。
6、处理凝胶同时，切一张同样大小硝酸纤维素膜。硝酸纤维素膜事先用2& SSC 浸泡。剪两张Whatman3#滤纸和吸水用的粗滤纸。注意不要用手直接触及膜面。
7、准备转移用容器和支架，容器中放20&SSC 。支架上搭滤纸桥使溶液能够虹吸上来。
8、依次放：处理好的凝胶，硝酸纤维素膜，吸水纸，玻璃板，500-1000g适量重物。
（注意：检查pH值，用硝酸纤维素膜时ph&9。要确保各层间没有气泡，否则会发生局部绝缘，气泡处的DNA 难以吸附到膜上。）&
9、室温转移12-20 h。
10、取出转移膜，用2 & SSC 漂洗数次，以去处困难吸附在膜上的凝胶。
11、固定：可选择下述方法之一进行DNA固定:
①、紫外线固定：使用长波紫外线照射10-20 min，简单漂洗干燥备用。
②、尼龙膜置于120℃&30min。
③、硝酸纤维素膜置于普通烘箱中65-70℃&3-4 h。&
三、.Southern杂交
印迹杂交成功的关键因素之一在于选择杂交液。应通过预实验来选择合适的杂交液。另一个比较重要的因素是标记探针的浓度，一般选择5-25ng/ml，应通过模拟杂交实验来选择合适的探针浓度。
（一）试剂
1、Standard buffer
2、Standard buffer 50%formamide
3、High SDS buffer
4、Wash Solution I :2x SSC, 0.1%SDS
5、Wash Solution II: 0.5x SSC , 0.1%SDS&
（二） 程序
1、将转移好的硝酸纤维素膜装入塑料袋中，每边各留2-4mm孔隙。灌注杂交液一边留1cm孔隙。在角上剪开一个小口灌注杂交液，从切口处赶走气泡，封膜机封口，浸入水浴中。
2、根据不同预杂交液，采用不同的温度预杂交4-20 h；Standard buffer ：预杂交温度65-68℃，standard buffer 50%formamide：37-42℃，High SDS buffer：37-42℃
3、使用双链DNA探针时，沸水浴10 min以变性探针。然后迅速插入冰中。
& &按模拟杂交实验所确定的探针浓度将适量探针加入到预杂交液中，配成杂交液， & 一般浓度5-25ng/ml。按每100cm2膜加入至少3.5ml配制杂交液。
4、使用和预杂交相同的杂交温度，一般杂交16-20 h。
5、杂交结束后，取出杂交袋，将杂交液倒入带盖试管中，储存于-20℃以备下次使用。这样至少可以保存一年。再次使用之前应在冻融之后，加热至 95℃&10min以变性探针。杂交液如含有50%甲酰胺，则在65℃变性10 min即可。
6、取出杂交膜，用Wash Solution I 次洗5 min& 3次。
7、保温冲洗：用 Wash Solution II 于68℃冲洗15 min& 2次。&
四、 BCIP/NBT 显色检测法
（一）试剂：&
1、Anti-DIG-AP碱性磷酸酶标记抗地高辛单抗体。
& & 2、 BC/NBT储备液。
3、 冲洗液：0. 1M Tris-HCl,0.15 M NaCl. PH=7.5.
4、 封闭液：1%Blocking Reagent/ &0.1M Tris-HCl ,0.15M NaCl.
5、 显色缓冲液：0.1mM Tris-HCl,0.1M NaCl, pH=9.5.
6、 TE缓冲液：10mM Tris，1mM EDTA，PH 8.0&
(二) 程序：
1、经过杂交及杂交后的冲洗之后，膜置于冲洗液中平衡1min。
2、用干净的杂交袋或平皿，封闭液室温封闭至少60 min。
3、用封闭液1：稀释 Anti-DIG-AP，例如2ul Anti-DIG-AP加至5-10ml封闭液中（根据染色情况而调整）。稀释液4℃可稳定12 h左右。
4、加Anti-DIG-AP，37℃&60min轻摇。
5、用冲洗液洗15min&3次，每次100ml。
6、按1：50配制底物显色液：例如100ul&BCIP/NTP储备液&加至5ml显色缓冲液中，未用完的显色剂应避光保存。
7、显色缓冲液20ml平衡2min后倾掉。
8、将膜及显色剂封在塑料袋中，加100ml底物显色液（100 cm2）开始避光显色。一般数分钟即开始出现颜色，显色过程可以持续 12 h（时间过长，背景增高）。避免震动，以免出现颜色带的移位。
9、 当所需要的显色点或带出现之后，用蒸馏水洗以终止反应。结果可以进行照相记录；也可以直接保存于TE中，在此情况下，颜色长期不退。或将膜干燥，颜色消褪，但若将膜放置于TE中，显色重新出现。
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