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历史上的今天
loftPermalink:'',
id:'fks_',
blogTitle:'【转载】LINUX下 bwa和samtools的安装',
blogAbstract:'
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网易公司版权所有&&
{list x.l as y}
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{list wl as x}{/list}bwa和samtools的安装
wget tar.bz2/download
tar jxvf bwa-0.5.9rc1.tar.bz2
cd bwa-0.5.9rc1
备注：我直接sudo apt-get bwa
就可以安装。按照系统提示来操作的。
Samtool安裝
1.下载Samtool
wget tar.bz2/download
2.解压Samtool
tar jxvf samtools-0.1.13.tar.bz2
cd samtools-0.1.13
之外Samtool还有一些脚本程序在misc这个文件夹里面
最后将和的工作目录加入PATH
vi .bash_profile
备注：我下载samtools文件包之后，解压，然后make出现问题“致命错误:
curses.h:没有那个文件或目录”，ubuntu系统中缺少一个套件ncurses devel ，把此套件安装下即可 $ sudo
apt-get install libncurses5-dev
然后make，通过。接下来按照如下操作：（添加路径之后，samtools就可以运行了）
fenglei@fenglei-Lenovo-G470:~/work/miRNA/samtools-0.1.19$
cat && /home/fenglei/.bashrc
export PATH=/home/fenglei/work/miRNA/samtools-0.1.19:$PATH
fenglei@fenglei-Lenovo-G470:~/work/miRNA/samtools-0.1.19$ source
/home/fenglei/.bashrc
fenglei@fenglei-Lenovo-G470:~/work/miRNA/samtools-0.1.19$
Program: samtools (Tools for alignments in the SAM format)
Version: 0.1.19-44428cd
Usage:&& samtools [options]
view&&&&&&&
SAM&-&BAM conversion
sort&&&&&&&
sort alignment file
mpileup&&&&
multi-way pileup
在export PATH之前加入 PATH=$PATH:的绝对路径:samtool的绝对路径，保存退出。
重新打开Shell事就可以直接使用和Samtool了
【参考资料】
1）http://www.plob.org//6.html/comment-page-1
2）http://blog.csdn.net/webhack/article/details/7062186
以上网友发言只代表其个人观点，不代表新浪网的观点或立场。Ubuntu12.04&64bit&下安装常见的二代测序等生信软件如samtools，bowtie,&tophat等
二代测序，我主要涉及illumina平台等hi-seq2000等RNA-seq数据处理，故尝试安装这些软件。
电脑上本来是Ubuntu12.04
32位等，结果发现有的软件只支持64位（如chip-seq的bismap），而且很多软件直接发布了编译好的64位可执行文件，而32位用源码编译会遇到很多麻烦（这里说的是tophat等），所以64位的linux的兼容性会更好。
我安装选择的是先用U盘burn一个liveUSB等64bit
Ubuntu，然后选择安装。试了好几遍都会遇到一些小问题，所以安装时最好选择网络连通，它会自动下载一些第三方程序，但安装时间会长一些。还有一个需要注意等是安装后有的电脑会出现花屏，估计是显卡驱动的问题，可以在进入系统后，选择additional
drivers，看看能否自动装上最新等显卡驱动，如果不行可以进入tty1，输入命令安装显卡驱动：
sudo apt- sudo apt-get dist- sudo apt-get
install nvidia-
首先二代序列处理会遇到很多格式，sam，bam，fastaq，sra（NCBI）等，能够处理和相互转换这些格式的工具就变得必不可少。主要有samtools（命令示例：samtools
view -bS file1.sam -o file.bam)，bedtools（bamToFastq等
命令示例：bamToFastq -i file1.bam -fa
file1.fastq)，sratools等，还有些软件自己附带的工具，如igvtools等等，现在对这些软件都还不熟悉。很多工具如tophat等还会基于samtools的API或者library，所以安装这些工具也是运行后续分析工具的前提。
samtools：
安装samtools，http://samtools.sourceforge.net/
下载最新samtools，samtools-0.1.19.tar.bz2，解压：tar -jvxf
samtools-*.tar.bz2 (j选项针对bz2结尾，也可在gui里选择解压）；
在终端cd到解压后等目录，输入make后可能会提示没有Zlib.h, 可以通过 sudo apt-get install
zlib1g-dev 来解决，这里还有个问题不记得是在装bwa还算samtools需要等文件，也可以现装上,
报错缺少curses.h, 可以 sudo apt-get install libncurses5-dev。再次输入make
clean，然后make，就能够在当前目录下编译生成可执行文件samtools，可以
a)将这个文件拷贝到你等PATH中去，如 sudo cp samtools /usr/local/bin ；也可
b)将该目录加入PATH：
export PATH=/home/yourname/bin:$PATH; 需要添加到启动.bashrc里实现永久添加
另外也可以
c)对samtools建立一个软连接，先cd进入/usr/local/bin目录，再输入
sudo ln -s /PATH/TO/samtools .
另外与samtools同时发布的还有 BCFtools (a collection of tools for calling
variants and manipulating VCF and BCF files).
下载BEDTools.v2.17.0.tar.gz，&，
解压， cd进解压后的目录，make，
如果提示没有g++，则用apt安装g++，再make，会生成./bin目录，里面就是可执行文件，将其加入PATH或复制到PATH，参见上文。
SAR Toolkit：
下载sratoolkit.2.3.2-5-ubuntu64.tar.gz， 解压， 里面有一个bin目录，将其添加到PATH
PATH=/home/yourname/bio/software/sratoolkit.2.3.2-5-ubuntu64/bin:$PATH
在32位系统中编译老通不过（可以sudo apt-get install bwa,
安装一个很老的版本），在64位系统中则很顺利。参见README：
git clone /lh3/bwa.git
（可以直接下载bwa-0.7.5a.tar.bz2）
sudo cp bwa /usr/local/bin， 使用示例：
./bwa index ref.fa
./bwa mem ref.fa read-se.fq.gz | gzip -3 & aln-se.sam.gz
./bwa mem ref.fa read1.fq read2.fq | gzip -3 & aln-pe.sam.gz
Bowtie有bowtie和bowtie2，两者可以同时安装，bowtie2对于大于50bp的reads
mapping更有优势，算法上也有所改进。
下载bowtie2-2.1.0-linux-x86_64.zip， unzip该文件，将里面的可执行文件弄到PATH里去。
如果只是下载编译好的可执行文件的话，比较简单，参见bowtie就可以了。 如果要自己编译，则要现装boost library，
SAMtools等一些library文件，总之，特别麻烦！
已投稿到：
以上网友发言只代表其个人观点，不代表新浪网的观点或立场。高通量测序数据的比对bwa、bowtie、bowtie2、samtools
1、bwa和samtools的安装
http://sourceforge.net/projects/bio-bwa/files/bwa-0.7.10.tar.bz2/download
tar jxvf bwa-0.7.10.tar.bz2
cd bwa-0.7.10
Samtool安裝
1.下载Samtool
http://sourceforge.net/projects/samtools/files/samtools/0.1.19/tar.bz2/download
2.解压Samtool
tar jxvf samtools-0.1.19.tar.bz2
cd samtools-0.1.19
之外Samtool还有一些脚本程序在misc这个文件夹里面
最后将bwa和samtools的工作目录加入PATH
export PATH=$PATH:bwa的绝对路径:samtool的绝对路径~/.bashrc
source ~/.bashrc
这样就可以直接使用bwa和Samtool了。
samtools一般是统计比对信息的，一些处理工作等。
bwa的使用：
BWA SYNOPSIS语法：
1）bwa index ref.fa
2）bwa aln ref.fa short_read.fq aln_sa.sai
3）bwa samse ref.fa aln_sa.sai short_read.fq aln-se.sam
3）bwa sampe ref.fa aln_sa1.sai aln_sa2.sai read1.fq read2.fq
aln-pe.sam
【bwa bwasw ref.fa long_read.fq aln.sam
bwa mem ref.fa reads.fq aln-se.sam
bwa mem ref.fa read1.fq read2.fq aln-pe.sam】
bwa的使用需要两种输入文件：
Reference genome data（fasta格式 .fa, .fasta, .fna）
Short reads data (fastaq格式 .fastaq, .fq)
step 1: 建立 Index
根据reference genome data(e.g. reference.fa) 建立 Index File
bwa index reference.fa
bwa index 指令更多的用法及 options，通过以下的命令来查看
step 2: 寻找 SA coordinates
如果是pair-end
数据（leftRead.fastq和rightRead.fastq）两个文件分别处理；single-end数据则直接处理。
bwa aln reference.fa leftRead.fastq leftRead.sai
bwa aln reference.fa rightRead.fastq rightRead.sai
bwa aln reference.fa singleRead.fastq singleRead.sai
如果希望多线程运行，在其中加入 -t这个参数，另外-f这个参数可以指定结果输出文件，如:
bwa aln -c -t 3 -f leftreads.sai reference.fa leftreads.fastq
step 3:转换SA coordinates输出为sam
如果是pair-end数据
bwa sampe -f pair-end.sam reference.fa leftRead.sai rightRead.sai
leftRead.fastq rightread.fastq
如果是single reads数据
bwa samse -f single.sam reference.fa single.sai single.fastq
值此Reads的mapping工作已经完成。接下来用samtools后续处理。
2、samtools使用方法
名称: samtools Sequence
Alignment/Map (SAM)格式的应用程序
samtools view ‐bhS -t ref_list.txt ‐o aln.bam aln.sam
samtools sort aln.bam aln.sorted
samtools index aln.sorted.bam
【samtools view aln.sorted.bam chr2:20,100,000&#,000
samtools merge out.bam in1.bam in2.bam in3.bam
samtools faidx ref.fasta
samtools pileup ‐f ref.fasta aln.sorted.bam
samtools tview aln.sorted.bam ref.fasta】
Samtools是一系列处理BAM格式序列的应用。它从SAM(Sequence
Alignment/Map)格式输入或者输出为SAM格式，可以进行排序，合并和建立索引，并且允许快速地检索任意区域的读段（reads）。
命令和选项：
1）samtoolsview [‐bhuHS] [‐t in.refList] [‐o
output] [‐f reqFlag] [‐F skipFlag] [‐q minMapQ] [‐l library] [‐r
read‐Group] in.bam|in.sam [region1
[...]]，提取/打印所有的或者部分序列文件。如果没有指定区域，所有的序列都将会被打印。否则，仅仅打印覆盖特定区域的序列才会被打印出来。如果一
个序列覆盖多个区域，那么它将会被多次打印出来。一个区域可以以如下例格式呈现：`chr2 (the whole chr2),
`chr2:1000000 (region starting from 1,000,000bp) or
`chr2:1,000,000&#,000 (region between 1,000,000 and 2,000,000bp
including the end
points).（即染色体名：起始打印位点..终止打印位点）位置是以1开始记录第一个碱基的方式定位（1-based
coordinate）。
-b 以BAM格式输出，可以用于samtools的后续分析
-u 以未压缩的BAM格式输出，可以节约时间，一般在管道执行时使用
-h 在结果中包含头header
-H 只输出头
-S 输入文件为SAM格式，如果确实@SQ头，则需要-t选项
这个文件是以TAB分隔的，每行必须包含参考序列名字（如染色体名），一行只包含单个参考序列名字，其它区域被忽略。这个文件定义排序是的参考序列顺序。
如果你运行samtools faidx ref.fa，得到的索引结果文件可以作为这里的FILE文件（见6）。
-o FILE 输出文件[stdout]，如果在该管道中可以使用command1|tee FILE|command2。
-f INT 只输出在FLAG中含有整个INT的序列，INT可以使用十六进制的/^0x[0‐9A‐F]+/ [默认0]
-F INT 跳过含有INT的序列
-q INT 跳过MAPQ（定位的质量）比INT小的序列[默认0]
-l STR 只输出STR库中的序列
-r STR 只输出在STR读段组中的序列
2）samtoolsimport in.ref_list in.sam
out.bam，从0.1.4起，它与samtools view ‐bt in.ref_list ‐o out.bam
in.sam意义相同。
3）samtoolssort [‐n] [‐m maxMem] in.bam
out.prefix，根据左起位点对序列排序，将产生out.prefix.bam文件，当整个序列无法完全装载到内存（‐m选项控制）时，可能还会产生out.prefix.%d.bam这个临时文件。
-n 设定排列方式为读段名称而非染色体位置
-m 设定内存使用量[](默认500M)
4）samtoolsmerge [‐h inh.sam] [‐n] out.bam in1.bam
[...]，将多个排序后的序列文件合并。参考头文件列出所有的输入BAM文件和inh.sam中@SQ头，如果存在，必须全部指向同一系列的参考序列。
参考头文件列表（除非被-h选项替代）和in1.bam中的“@”头将会被拷贝到out.bam中，其他的输入文件中的头将会被忽略。
使用FILE中的行作为@头拷贝到out.bam中，代替从in1.bam中拷贝的头。（FILE实际上是BAM格式的。但是其中的任何序列信息都会被忽略）。
-n 输入文件是以读段名称排序的，而非染色体定位（当sort中使用-n选项时，此处应该选-n）。
5）samtoolsindex aln.bam
对排序后的序列索引，用于快速的随机处理，此处将产生aln.bam.bai文件。
6）samtools faidx ref.fasta [region1
[...]]，对FASTA格式的参考基因组序列建立索引或者提取已经索引的序列中的子序列（subsequence）。如果没有指定区域，它将会索引文
件，并在磁盘上建立ref.fasta.fai，子序列将会被检索并且以FASTA格式打印在标准输出。输入文件可以压缩成RAZF格式。
7）samtoolspileup [‐f in.ref.fasta] [‐t
in.ref_list] [‐l in.site_list] [‐iscgS2] [‐T theta] [‐N nHap] [‐r
pairDiffRate]
in.bam|in.sam，以pileup格式输出序列，在pileup格式中，每一行代表一个基因组位点，包括染色体名称、位点、参考碱基、读段质量
和序列定位质量。匹配、错配、插入和缺失、链、mapping质量以及读段的开始和结束位点都在读段碱基一列。在这一列中，点代表与参考序列的正向链匹
配，逗号表示与参考序列的反向链匹配，ACTGN代表正向链上的错配，而actgn代表反向链上的错配，+[0‐9]+[ACGTNacgtn]+这一模
式表示在参考序列之间存在插入序列，模式中，数字代表插入长度，其后为插入序列。9]+[ACGTNacgtn]+这一模式代表与参考序列相比存
在缺失，后面以*代表被删除的碱基。在读段碱基列中，符号^标记一个读段片段的起始，它是读段中被N/S/H
CIGAR操作符分隔开临近的子序列（subsequence）。^后面紧跟的ASCII码字符减去33给出mapping质量。$符号标记读段片段
（read segment）的结尾。（注意-c选项不同的输出）
果应用-c选项，一致碱基、Phred-scaled一致性质量、SNP质量（指与参考序列相同的Phred-scaled一致性的可能性）和包含该位点
的读段mapping质量均方根（root mean square
RMS）将会被插入到参考碱基和读段序列之间（即会多出几列）。插入缺失将占有额外一列。
每个插入缺失行包含染色体名称、位点、*、基因型、一致性质量、SNP质量、mapping质量均方根，#支持第一种等位序列的读段，#支持第二种等位序列的读段，#与前两种等位形式不同且包含插入缺失的读段。
-s 最后一行打印mapping质量。这一选项使得输出结果易于分析，但较耗费空间
-S 输入文件时SAM格式
-i 只输出含有插入缺失的pileup行
-f FILE FASTA格式的参考序列，如果缺少索引文件将产生FILE.fai
-M INT设定mapping质量上限（cap）为INT
-t FILE以import
命令描述的格式列出参考名称和序列长度列表。如果出现这一个选项，samtools将假设输入文件为SAM格式；否则假设为BAM格式。
FILE指定pileup输出的位点，第一列为染色体，第二列为1-based位点。其他的列将会被忽略，推荐与-s选项同时使用，因为默认格式我们可能无法知道mapping质量
-c 使用MAQ一致性模型检测一致序列，在使用-g和-c选项时，仅-T、-N、-l和-r选项可用
-g 产生GLFv3格式的基因型相似性，这一选项抑制-c、-i和-s选项
-T FLOAT MAQ一致性检测模式的theta参数[0.85]（错误依赖系数）
-N INT样本中的单倍型数量[默认2，要求=2]
-r FLOAT 每一对单倍体之间期望的片段差异值[0.001]
-I(i) INT 序列中插入缺失的Phred概率[40]
8）samtoolstview in.sorted.bam
[ref.fasta]，文本定位查看器，在查看器中，使用？取得帮助，按下g从一个区域开始位置检查定位（alignment），格式如chr10:10,000,000。
9）samtools fixmate in.nameSrt.bam
out.bam，为以名称排序的定位alignment填入配对坐标，ISIZE（inferred insert
size猜测的插入序列大小）和配对相应的标签（flag）
10）samtoolsrmdup input.srt.bam
out.bam，移除潜在的PCR重复：如果多个读段含有相同的外部位点（external
coordinates），只保留那些高mapping质量的碱基对。这一命令只适用于FR开始的并且要求正确设置ISIZE。
11）samtoolsrmdupse input.srt.bam
out.bam，除去单端读段（single-ended
reads）。这一命令将把所有的读段当作单端读段，即使它们实际上是配对的。
12）samtools fillmd [‐e] aln.bam
ref.fasta，产生MD标签，如果已经存在并且产生的MD标签不同，这个命令将给予警告。
-e 如果读段碱基与参考序列相同，将其转换成=，indel检测目前还不支持=作为碱基标志。
SAM是以TAB分隔的，除去以@开始的header行，每一定位行（alignment）包含以下项目：
|Col | Field | Description |
+‐‐‐‐+‐‐‐‐‐‐‐+‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐+
| 1 | QNAME | Query (pair) NAME 读段对应模板名称|
| 2 | FLAG | bitwise FLAG 按位的标签（意义见后面）|
| 3 | RNAME | Reference sequence NAME 参考序列名称|
| 4 | POS | 1‐based leftmost POSition/coordinate of clipped
sequence 1-based左起位置/整齐的序列定位|
| 5 | MAPQ | MAPping Quality (Phred‐scaled) 读段定位质量|
| 6 | CIAGR | extended CIGAR string 扩展的CIGAR字符串（详见SAM格式详解）|
| 7 | MRNM | Mate Reference sequence NaMe (`= if same as RNAME)
配对的参考序列名称，=表示相同|
| 8 | MPOS | 1‐based Mate POSistion 参考序列中1-based配对位置|
| 9 | ISIZE | Inferred insert SIZE 猜测的插入序列大小|
|10 | SEQ | query SEQuence on the same strand as the reference
与参考序列处于同一链的读段序列|
|11 | QUAL | query QUALity (ASCII‐33 gives the Phred base quality)
度短序列的碱基质量ASCII码-33为碱基质量|
|12 | OPT | variable OPTional fields in the format TAG:VTYPE:VALUE
变量选项，格式TAG:VTYPE:VALUE |
+‐‐‐‐+‐‐‐‐‐‐‐+‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐+
下表列出了FLAG列的含义：
+‐‐‐‐‐‐‐+‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐+
| Flag | Description |
+‐‐‐‐‐‐‐+‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐+
|0x0001 (1)| the read is paired in sequencing |读段序列是成对的
|0x0002 (2)| the read is mapped in a proper pair |读段定位在适当位置
|0x0004 (4)| the query sequence itself is unmapped |读段序列自身没有定位
|0x0008 (8)| the mate is unmapped |与其配对的读段为定位
|0x0010 (16)| strand of the query (1 for reverse) |读段对应链
|0x0020 (32)| strand of the mate |配对链
|0x0040 (64)| the read is the first read in a pair |读段是读段对的第一个
|0x)| the read is the second read in a pair
|读段是读段对的第二个
|0x)| the alignment is not primary |定位不是最优选
|0x)| the read fails platform/vendor quality checks
|读段质量未生成
|0x)| the read is either a PCR or an optical duplicate
|读段是PCR或者光学重复
+‐‐‐‐‐‐‐+‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐+
1、 在bam_import.c, bam_endian.h, bam.c和bam_aux.c中的非定位单词
2、 CIGAR操作符P不能正确处理
3、 合并时，输入文件需要有相同数目的参考基因序列。设备要求可以降低，另外，合并时不会自动重构头字典（header
dictionary）。用户必须提供正确的头，Picard做合并表现更好。
4、 samtools的rmdup无法处理单端数据，不能移除染色体之间的重复。Picard表现更好。
3、bowtie的使用
现在举个例子来探讨bowtie的使用方法：现在有GENOME.fa、高通量测序数据Reads.fa，我们希望将Reads.fa比对到基因组GENOME.fa上。
（一）、对Reference文件(GENOME.fa)建库
bowtie-build GENOME.fa GENOME.fa
建库步骤可能需要1h甚至几个小时，建议在后台执行：
nohup bowtie-build GENOME.fa GENOME.fa
（二）、将Reads.fa比对到GENOME.fa上，只能比对到正链，且匹配到基因组不多于20个不同位置，允许有1个错配
bowtie -f-a-m20-v1--al Reads_aligned --un Reads_unaligned --norc
GENOME.fa Reads.fa Reads.bwt 2 log
（三）、bowtie输出结果的说明
sample001_x75 + Chr1 12453 ATCGGCCAATTACGGACTTAA
IIIIIIIIIIIIIIIIIIIII 4 9:GT
1 2 3 4 5 6 7 8
第2列为+时：最左端的数字9表示query从5端数起，第10个碱基为T，而对应的reference为G;
第2列为-时：最左端的数字9表示query先作反向互补，然后从3端数起，第10个碱基为T，而对应的reference为G;
4、bowtie2
1）下载（wget
http://sourceforge.net/projects/bowtie-bio/files/bowtie2/2.2.3/bowtie2-2.2.3-linux-x86_64.zip/download）
解压 unzip bowtie2-。。。。
2）Set the BT2_HOME environment variable to point to the new Bowtie
2 directory containing the bowtie2, bowtie2-build and
bowtie2-inspect binaries. 【将 其加入环境变量（确保bowtie2,bowtie2-build or
bowtie2-inspect能使用】
3）建索引：
$ bowtie2-build genome.fasta index
$ bowtie2 -p 8 -x index -1 reads1.fq -2 reads2.fq -S out.sam
以一个例子详细说明：
【【【【Bowtie 2 comes with some example files to get you started. The
example files are not scient we use theLambda
phage reference genome simply because its short, and the reads were
generated by a computer program, not a sequencer. However, these
files will let you start running Bowtie 2 and downstream tools
right away.
First follow the manual instructions to obtain Bowtie 2. Set the
BT2_HOME environment variable to point to the new Bowtie 2
directory containing the bowtie2, bowtie2-build and bowtie2-inspect
binaries. This is important, as the BT2_HOME variable is used in
the commands below to refer to that directory.
Indexing a reference genome
To create an index for the Lambda phage reference genome included
with Bowtie 2, create a new temporary directory (it doesnt matter
where), change into that directory, and run:
$BT2_HOME/bowtie2-build $BT2_HOME/example/reference/lambda_virus.fa
lambda_virus
The command should print many lines of output then quit. When the
command completes, the current directory will contain four new
files that all start with lambda_virus and end with .1.bt2, .2.bt2,
.3.bt2, .4.bt2, .rev.1.bt2, and .rev.2.bt2. These files constitute
the index - youre done!
You can use bowtie2-build to create an index for a set of FASTA
files obtained from any source, including sites such asUCSC, NCBI,
and Ensembl. When indexing multiple FASTA files, specify all the
files using commas to separate file names. For more details on how
to create an index with bowtie2-build, see the manual section on
index building. You may also want to bypass this process by
obtaining a pre-built index. See using a pre-built index below for
an example.
Aligning example reads
Stay in the directory created in the previous step, which now
contains the lambda_virus index files. Next, run:
$BT2_HOME/bowtie2 -x lambda_virus -U
$BT2_HOME/example/reads/reads_1.fq -S eg1.sam
This runs the Bowtie 2 aligner, which aligns a set of unpaired
reads to the Lambda phage reference genome using the index
generated in the previous step. The alignment results in SAM format
are written to the file eg1.sam, and a short alignment summary is
written to the console. (Actually, the summary is written to the
standard error or stderr filehandle, which is typically printed to
the console.)
To see the first few lines of the SAM output, run:
head eg1.sam
You will see something like this:
@HD VN:1.0 SO:unsorted@SQ SN:gi|9626243|ref|NC_|
LN:48502@PG ID:bowtie2 PN:bowtie2 VN:2.0.1r1 0
gi|9626243|ref|NC_| M * 0 0
TGAATGCGAACTCCGGGACGCTCAGTAATGTGACGATAGCTGAAAACTGTACGATAAACNGTACGCTGAGGGCAGAAAAAATCGTCGGGGACATTNTAAAGGCGGCGAGCGCGGCTTTTCCG
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GTCAGGAAAGTGGTAAAACTGCAACTCAATTACTGCAATGCCCTCGTAATTAAGTGAATTTACAATATCGTCCTGTTCGGAGGGAAGAACGCGGGATGTTCATTCTTCATCACTTTTAATTGATGTATATGCTCTCTT
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TCGATTTGCAAATACCGGAACATCTCGGTAACTGCATATTCTGCATTAAAAAATCAACGCAAAAAATCGGACGCCTGCAAAGATGAGGAGGGATTGCAGCGTGTTTTTAATGAGGTCATCACGGGATNCCATGTGCGTGACGGNCATCGGGAAACGCCAAAGGAGATTATGTACCGAGGAAGAATGTCGCT
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TCAGCCGGACGCGGGCGCTGCAGCCGTACTCGGGGATGACCGGTTACAACGGCATTATCGCCCGTCTGCAACAGGCTGCCAGCGATCCGATGGTGGACAGCATTCTGCTCGATATGGACANGCCCGGCGGGATGGTGGCGGGG
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AS:i:-6 XN:i:0 XM:i:2 XO:i:0 XG:i:0 NM:i:2 MD:Z:98G21C22
The first few lines (beginning with @) are SAM header lines, and
the rest of the lines are SAM alignments, one line per read or
mate. See the Bowtie 2 manual section on SAM output and the SAM
specification for details about how to interpret the SAM file
Paired-end example
To align paired-end reads included with Bowtie 2, stay in the same
directory and run:
$BT2_HOME/bowtie2 -x lambda_virus -1
$BT2_HOME/example/reads/reads_1.fq -2
$BT2_HOME/example/reads/reads_2.fq -S eg2.sam
This aligns a set of paired-end reads to the reference genome, with
results written to the file eg2.sam.
Local alignment example
To use local alignment to align some longer reads included with
Bowtie 2, stay in the same directory and run:
$BT2_HOME/bowtie2 --local -x lambda_virus -U
$BT2_HOME/example/reads/longreads.fq -S eg3.sam
This aligns the long reads to the reference genome using local
alignment, with results written to the file eg3.sam.
Using SAMtools/BCFtools downstream
SAMtools is a collection of tools for manipulating and analyzing
SAM and BAM alignment files. BCFtools is a collection of tools for
calling variants and manipulating VCF and BCF files, and it is
typically distributed with SAMtools. Using these tools together
allows you to get from alignments in SAM format to variant calls in
VCF format. This example assumes that samtools andbcftools are
installed and that the directories containing these binaries are in
your PATH environment variable.
Run the paired-end example:
$BT2_HOME/bowtie2 -x $BT2_HOME/example/index/lambda_virus -1
$BT2_HOME/example/reads/reads_1.fq -2
$BT2_HOME/example/reads/reads_2.fq -S eg2.sam
Use samtools view to convert the SAM file into a BAM file. BAM is a
the binary format corresponding to the SAM text format. Run:
samtools view -bS eg2.sam eg2.bam
Use samtools sort to convert the BAM file to a sorted BAM file.
samtools sort eg2.bam eg2.sorted
We now have a sorted BAM file called eg2.sorted.bam. Sorted BAM is
a useful format because the alignments are (a) compressed, which is
convenient for long-term storage, and (b) sorted, which is
conveneint for variant discovery. To generate variant calls in VCF
format, run:
samtools mpileup -uf $BT2_HOME/example/reference/lambda_virus.fa
eg2.sorted.bam | bcftools view -bvcg - eg2.raw.bcf
Then to view the variants, run:
bcftools view eg2.raw.bcf
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