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作者：，欢迎留言之前有人问我为啥喜欢的都是受音，我听剧时间不长，除了阿春根本听不出其他攻音谁是谁。然后那个朋友跟我推荐她本命的FT，之后问我怎么样，我说我就听出他“哈哈”的笑声很像东万，说得她无语了 - - 早些时候我说我听不出来你的声音，她跟我说你说话的声音软软的很好听。后来你发啪啪我就想，你说东北话肯定特彪悍。废话了一下午估计你肯定烦了，我不说了，你清静清静吧。
噗！被猜中了，说东北话就很彪悍的人路过……&& 查看话题
问各位大神，为啥扩不出目的片段却扩出来几条短片段？
目的片段2300bp左右，上下游引物均带酶切位点30+bp，用于表达。
模板是从病料里提RNA然后反转录得的cDNA。
因为Tm值接近80，所以用两步法PCR。重复做了几次都是如图结果，没得到目的条带，却在500bp左右有2-3条短条带。
谁能告诉我这是为什么啊？
原因有可能有两种：第一GC太高，导致扩增出来的产物都是缺失的，第二就是模板重复较多而且高GC，只能扩出小的片段来 我觉得楼主是pcr 扩增有时出现涂抹带或片状带或地毯样带。
其原因往往由于酶量过多或酶的质量差，dNTP 浓度过高（非特异性扩增多），Mg离子浓度过高，变性温度过低（导致DNA双链没有充分变性为单链），退火温度太低导致酶活力不足，循环次数过多引起。其对策有：1.减少酶量，或调换另一来源的酶。2.减少 dntp 的浓度。3.适当降低 mg离子的 浓度。4.增加模板量，减少循环次数。5.可以适当地分梯度提高变性温度。6.适当分梯度调高退火温度。 : Originally posted by a at
原因有可能有两种：第一GC太高，导致扩增出来的产物都是缺失的，第二就是模板重复较多而且高GC，只能扩出小的片段来 延长变性时间可以吗 : Originally posted by calorimetry at
我觉得楼主是pcr 扩增有时出现涂抹带或片状带或地毯样带。
其原因往往由于酶量过多或酶的质量差，dNTP 浓度过高（非特异性扩增多），Mg离子浓度过高，变性温度过低（导致DNA双链没有充分变性为单链），退火温度太 ... 我用的是phusion超保真酶。体系：10ul buffer，1ul dntp，2.5ul primerF,2.5ul primerR,0.5ul 酶，5ul cDNA,28.5ul ddH2O。程序：98 30s，（98 10s，72 1min30s）循环35次，72 10min。
我的引物Tm值都是80度左右。
你帮我看看有什么问题呗，谢谢！ : Originally posted by MIMPI at
我用的是phusion超保真酶。体系：10ul buffer，1ul dntp，2.5ul primerF,2.5ul primerR,0.5ul 酶，5ul cDNA,28.5ul ddH2O。程序：98 30s，（98 10s，72 1min30s）循环35次，72 10min。
我的引物Tm值都是80度左右。 ... 把循环次数降低点，另外重新提一下DNA模板。 : Originally posted by MIMPI at
我用的是phusion超保真酶。体系：10ul buffer，1ul dntp，2.5ul primerF,2.5ul primerR,0.5ul 酶，5ul cDNA,28.5ul ddH2O。程序：98 30s，（98 10s，72 1min30s）循环35次，72 10min。
我的引物Tm值都是80度左右。 ... 楼主可以增加一些DMSO（不超过体系的6%），这将便于氢键的解离，适用于高GC含量的扩增体系，延伸时间有些短，可以调节成2分30秒，循环设为三十个循环就够了，如不行可按上述体系在做个touching down 加入少量BSA也可以，不超过反应体系的10%。 : Originally posted by calorimetry at
加入少量BSA也可以，不超过反应体系的10%。 我的模板的GC%并不高，48%，之前我用不加酶切位点的引物扩出来过，但是加上了酶切位点就不行，应该还是程序的问题吧？ : Originally posted by MIMPI at
我的模板的GC%并不高，48%，之前我用不加酶切位点的引物扩出来过，但是加上了酶切位点就不行，应该还是程序的问题吧？... 加上酶切位点？怎么加？是外接上片段还是先行有限酶解？
不过，我认为不管是接上新片段还是切掉原有片段，肯定都引起了引物与新的互补片段的结合的专一性的问题。因此需要重新设计引物。 已解决~thx当前位置：&>&&>&
餐桌问答：咸鸭蛋黄为啥会出油？
&&& 作者：&& 来源：人民网-生命时报
关键词： 出油 蛋白质 蛋黄油 咸鸭蛋 鲜蛋
[提要]鸭蛋的脂肪含量比鸡蛋多，制成咸蛋后蛋黄脂肪含量可高达30%，蛋白软嫩，蛋黄油分四溢，松沙可口。需要注意的是，咸鸭蛋含盐量一般很高，类似于佐餐的咸菜，因此心脑血管病人、高血压、高血脂病人要少吃或尽量不吃，健康人吃后应该多喝水。
　　河北读者张先生问：我特别爱吃咸鸭蛋，尤其喜欢吃流油的，我想问问咸鸭蛋黄为啥会出油？这些油对身体好不好？
　　中国农业大学食品科学与营养工程学院副教授范志红答：鲜蛋成分中的蛋白质和脂肪在正常情况下呈均匀的乳状液分布，鲜蛋直接煮熟时，蛋中蛋白质和脂肪的乳状液直接凝固变成凝块，油脂来不及析出，仍被分散在蛋白质凝块中，因此不见出油。而鲜蛋用盐腌制的过程中，盐分侵入蛋内，蛋白质发生“盐析”作用而缓慢地变性凝固，将油脂从蛋白质组织中挤出而聚集在一起，蛋中的蛋白质及脂肪已分别存在，所以咸蛋煮熟切开后能看到明显出油。鸭蛋的脂肪含量比鸡蛋多，制成咸蛋后蛋黄脂肪含量可高达30%，蛋白软嫩，蛋黄油分四溢，松沙可口。当然，由于每种蛋的脂肪含量以及腌制方法不同，有的咸蛋黄不会流油。只要适量食用，这些油不会伤害身体。
　　需要注意的是，咸鸭蛋含盐量一般很高，类似于佐餐的咸菜，因此心脑血管病人、高血压、高血脂病人要少吃或尽量不吃，健康人吃后应该多喝水。▲
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