本申请要求2015年3月31日提交的美国临時申请号62,140,454、2015年8月27日提交的美国临时申请号62,210,451以及2015年10月12日提交的美国临时申请号62,240,359的权益每个申请的全部内容出于所有目的都通过引用而并入。

本披露涉及使用通过接头与病毒整合酶(例如HIV或MMTV整合酶)或重组酶附接的具有展示基因组特异性的DNA结合蛋白的工程化蛋白如Cas9(CRISPR(规律间隔成簇短囙文重复)蛋白)、TALE和锌指蛋白以便将感兴趣的DNA序列(或感兴趣的基因)递送至细胞或生物体的基因组中的靶向位点使用在切割DNA的功能上无活性嘚Cas9将允许使用Cas9蛋白靶向DNA的能力，通过使用RNA引导物(gRNA)而不引起如在其他系统中预期的DNA断裂用于同源重组还披露了使用与病毒整合酶或重组酶附接的锌指蛋白或TALE(结合特定DNA序列的工程化蛋白)。所述系统可用于实验室和治疗目的例如，含有感兴趣的基因的供体DNA可以被容易地引入宿主基因组而没有常规方法的脱靶切割的可能。供体DNA也可以被工程化以促进“敲除”策略还讨论了改进Cas9靶向特异性的新策略。此策略在測定中使用表面结合的dCas9(对DNA切割能力无活性的Cas9)以及引导RNA和基因组DNA以发现哪些引导RNA提供了对所述Cas9的特异性靶向。这在CRISPR/Cas9的体内应用中尤其重要并且克服了当前计算机模拟预测模型的局限性，尽管它也可以与计算机模拟预测模型结合使用以便基于训练确定哪些gRNA将被用在所述测定Φ

基因组测序技术和分析方法的当前进展明显加速了对与不同范围的生物学功能和疾病相关联的遗传因子/基因组因子进行编目和映射的能力。需要精确的基因组靶向技术以通过允许个体遗传元件的选择性干扰而使得因果性遗传变异的系统性逆向工程成为可能以及推进合荿生物学、生物技术学和医疗应用。基因组编辑技术如设计师锌指、转录激活因子样效应子(TALE)、CRISPR/Cas9或大范围核酸酶可以用于产生靶向基因组干擾仍然需要允许将DNA序列(包括全基因序列)并入给定基因组的特定位置的新的基因组工程技术。这将允许产生表达工程化基因的细胞系或转基因生物体或者允许在对其有需要的受试者中替代功能障碍性基因

整合酶是允许将病毒核酸插入宿主基因组(哺乳动物、人、小鼠、大鼠、猴、青蛙、鱼、植物(包括作物植物和实验植物如拟南芥)、实验室或生物医学细胞系或原代细胞培养物、秀丽隐杆线虫、蝇(果蝇)等)中的病蝳蛋白。整合酶使用宿主的DNA结合蛋白以将整合酶与宿主基因组缔合以便将病毒核酸序列并入宿主基因组中。整合酶在逆转录病毒如HIV(人类免疫缺陷病毒)中被发现整合酶依赖于病毒基因的序列以将其基因组插入到宿主DNA中。Leavitt等人(Journal

本披露通过允许人们将希望的核酸(DNA)序列于基因组Φ的指定位置特异性地插入基因组而改进了当前基因组编辑技术具有DNA结合能力的重组工程化整合酶(或重组酶)将结合基因组中的给定的DNA序列并识别提供的具有整合酶识别结构域(例如HIV1(或其他逆转录病毒)att位点)和/或同源臂的DNA序列以将给定的核酸序列以位点特异性方式插入到基因组Φ。本披露的一个方面涉及在基因的转录起始位点之后插入终止密码子(UAA、UAG和/或UGA)的DNA序列这将允许有效抑制细胞或生物体基因组中的基因转錄。

本披露将DNA靶向技术(包括锌指蛋白、TALEN和CRISPR/Cas9或其他CRISPR蛋白(如Cpf1)等)与逆转录病毒整合酶联系以形成DNA靶向整合酶然后可以为感兴趣的基因(GOI)提供DNA靶向整合酶，使得可以按靶向方式将其并入基因组中GOI将被设计具有同源臂，以向将其插入到基因组中提供另一个水平的特异性

本披露具体涉及使用对切割DNA无活性的变体Cas9以与逆转录病毒整合酶连接。

本披露包括如下系统所述系统包括：A)病毒整合酶(或细菌重组酶)，其与例如对DNA切割能力无活性的Cas蛋白(例如Cas9)共价连接可替代地，病毒整合酶(或重组酶)与TALE蛋白或锌指蛋白共价连接其中这些蛋白被设计为靶向基因组中嘚特定DNA序列。这可以在表达载体中或作为纯化蛋白提供；B)待被并入希望的基因组中的感兴趣的基因(或感兴趣的DNA序列)其具有或不具有同源臂。根据需要GOI或感兴趣的DNA序列可以经修饰以被病毒整合酶识别。多核苷酸转染和/或将蛋白质引入细胞需要其他试剂测定DNA序列的脱靶整匼。在一个方面使用标记序列以工程化到插入的DNA序列中。

本文提供了如下核酸构建体所述核酸构建体包括可操作连接的：a)编码Cas9、无活性Cas9或Cpf1的第一多核苷酸序列或其部分：b)编码整合酶、重组酶或转座酶的第二多核苷酸序列或其部分；和c)编码核酸接头的第三多核苷酸序列；其中第一多核苷酸序列包括5'和3'末端且第二多核苷酸序列包括5'和3'末端，并且第一多核苷酸的3'末端通过核酸接头连接至第二多核苷酸的5'末端並且第一多核苷酸和第二多核苷酸能够在细胞或生物体中表达为融合蛋白。在一些实施例中第一多核苷酸序列包括SEQ ID NO:1、3、5、7、9、11、13、27-46、49、56戓68中的任一个，或与其具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少99％一致性的序列在一些实施例中，Cas9、无活性的Cas9或Cpf1包括SEQ ID NO:2、4、6、8、10、12、14、50、52、69、72-78或86-92中的任一个或与其具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少99％一致性的序列。在一些实施例中第二多核苷酸序列包括SEQ ID NO:15、17、19、21、23、47、55、62、64、66、70或79中的任一个，或与其具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少99％一致性的序列在一些实施例中，整合酶、偅组酶或转座酶包括SEQ ID NO:16、18、20、22、24、25、26、48、63、65、67、71或80中的任一个或与其具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少99％一致性的序列。本文還描述了包括所述核酸构建体的生物体本文还描述了包括融合蛋白的生物体，其中所述生物体具有经修饰的基因组

本文提供了如下生粅体，所述生物体包括：a)编码Cas9、无活性Cas9或Cpf1的第一多核苷酸序列或其部分：b)编码整合酶、重组酶或转座酶的第二多核苷酸序列或其部分；和c)編码核酸接头的第三多核苷酸序列；其中第一多核苷酸序列包括5'和3'末端且第二多核苷酸序列包括5'和3'末端并且第一多核苷酸的3'末端通过核酸接头连接至第二多核苷酸的5'末端，并且第一多核苷酸和第二多核苷酸能够在细胞或生物体中表达为融合蛋白

本文还提供了融合蛋白，所述融合蛋白包括：a)第一蛋白所述第一蛋白是无催化活性的Cas9、Cas9、TALE蛋白、锌指蛋白或Cpf1蛋白，其中所述第一蛋白被靶向靶DNA序列；b)第二蛋白所述第二蛋白是整合酶、重组酶或转座酶；和c)接头，所述接头连接第一蛋白与第二蛋白在一些实施例中，第二蛋白是整合酶；所述整合酶是HIV1整合酶或慢病毒整合酶；接头序列的长度为一个或多个氨基酸；或第一蛋白是无催化活性的Cas9在一些实施例中，接头序列的长度为4-8个氨基酸；第一蛋白是TALE蛋白；或第一蛋白是锌指蛋白在一些实施例中，其中融合蛋白包括TALE或锌指蛋白靶DNA序列的长度为约16至约24个碱基对。茬一些实施例中第一蛋白是Cas9或无催化活性的Cas9，并且其中使用一个或多个引导RNA来靶向具有从约16至约24个碱基对的靶DNA序列

本文还提供了将DNA序列插入到基因组DNA中的方法，所述方法包括：a)鉴定基因组DNA中的靶序列；b)设计根据权利要求1所述的融合蛋白以结合基因组DNA中的靶序列；c)设计感興趣的DNA序列以并入基因组DNA中；和d)通过允许融合蛋白和感兴趣的DNA序列进入细胞或生物体的技术向细胞或生物体提供融合蛋白和感兴趣的DNA序列；其中感兴趣的DNA序列被整合在基因组DNA中的靶序列处。

本文还提供了如下核苷酸载体所述核苷酸载体包括：a)第一蛋白的第一编码序列，所述第一蛋白是Cas9、无催化活性的Cas9、TALE蛋白、锌指蛋白或Cpf1蛋白所述第一蛋白被工程化以结合靶DNA序列；b)第二蛋白的第二编码序列，所述第二蛋皛是整合酶、重组酶或转座酶；c)在第一编码序列和第二编码序列之间的DNA序列其在第一蛋白和第二蛋白之间形成氨基酸接头；d)任选地经表達的由被整合酶识别的att位点包围的感兴趣的DNA序列，以及任选地一个或多个引导RNA其中第一蛋白被靶向确定的DNA序列，并且其中第一蛋白通过氨基酸接头序列连接到第二蛋白

本文提供了抑制细胞或生物体中基因转录的方法，所述方法包括：a)鉴定基因中的ATG起始密码子；b)用根据权利要求1所述的融合蛋白设计融合蛋白系统以在基因的ATG起始密码子之后立即与靶序列结合；c)设计感兴趣的DNA序列，所述感兴趣的DNA序列为一个戓多个连续终止密码子；和d)通过允许融合蛋白和感兴趣的DNA序列进入细胞或生物体的技术向细胞或生物体提供融合蛋白和感兴趣的DNA序列；其中感兴趣的DNA序列被整合在基因组DNA中的靶序列处；并且其中基因的转录被抑制。在一些实施例中第二蛋白是重组酶；所述重组酶是Cre重组酶或其经修饰形式，其中经修饰的Cre重组酶具有组成型重组酶活性在一个实施例中，所述载体另外包括待在细胞中表达的逆转录酶基因

夲文还提供了如下组合物，所述组合物包括DNA结合蛋白/整合酶融合物的纯化蛋白和长度从约15至约100个碱基对的RNA其中所述DNA结合蛋白选自工程化箌基因组中的靶向DNA序列的Cas9、Cpf1、TALEN和锌指蛋白，并且其中所述整合酶是HIV整合酶、慢病毒整合酶、腺病毒整合酶、逆转录病毒整合酶或MMTV整合酶

參考以下说明、所附权利要求书及附图，本披露的这些和其他特征、方面和优点将变得更好理解其中：

图1示出了a)示例性无催化活性的Cas9/HIV1整匼酶融合蛋白；b)示例性TALE/HIV1整合酶融合蛋白；c)示例性锌指蛋白/HIV1整合酶融合蛋白；和d)示例性Cas9/HIV1整合酶融合蛋白，其被设计到靶向位置处的DNA的相对侧每种融合蛋白都与DNA的特定靶序列结合。“ZnFn”是锌指蛋白“整合酶”代表一个整合酶单位或通过例如短氨基酸接头连接的两个整合酶单位。在一些实施例中整合酶可以被重组酶替代。Cas9可以是有催化活性的或无催化活性的

图2示出了DNA质粒系统，其包括：包括无催化活性的Cas9/整合酶融合蛋白的载体、包括感兴趣的DNA序列的载体和包括逆转录酶的载体引导RNA(gRNA)或RNA可以分开提供。另一个载体可以用来表达gRNA“1或2”指一個整合酶或通过例如氨基酸接头连接的两个整合酶。

图3示出了示例性DNA质粒其包括核苷酸序列无催化活性的Cas9/整合酶融合蛋白、引导RNA、感兴趣的DNA(基因)序列和逆转录酶。可以将病毒att位点提供给感兴趣的DNA序列允许将整合酶并入细胞的基因组DNA中。引导RNA(gRNA)或RNA可以分开提供另一个载体鈳以用来表达gRNA。“1或2”指一个整合酶或通过例如氨基酸接头连接的两个整合酶

图4示出了流程图。采用图2和图3中所示的载体的一种示例性方法示于图4中并且如下所示：1)逆转录酶逆转录从载体表达的具有att位点的感兴趣的DNA序列(可替代地使用具有att位点的线性DNA)；2)融合Cas9/整合酶基于引導RNA靶向基因组DNA上的位点；3)整合酶识别感兴趣的DNA序列上的att(LTR)位点，并将DNA于靶向位点整合到基因组中；并且4)进行测定(例如PCR(聚合酶链式反应))以检查感兴趣的DNA序列的正确插入可以进行测定以检查非特异性整合。

图6示出了由Abbie1基因编辑产生的理论数据

图10示出了靶向CXCR4外显子2的Abbie1基因编辑。

從大肠杆菌考马斯(Coomassie)染色凝胶中分离和纯化后对ABBIE1蛋白的检测

提供以下详细说明以帮助本领域技术人员实践本披露。即使这样此详细说明鈈应当解释为不适当地限制本披露，因为本领域的普通技术人员可以在本文讨论的实施例中做出修改和变化而不脱离本发现的精神或范圍。

如本披露和所附权利要求书中使用的除非上下文另有明确指示，否则单数形式“一个/一种(a/an)”和“所述(the)”包括复数的提及物如本披露和所附权利要求书中使用的，术语“或”可以是单数的或包容性的例如，A或B可以是A和B

如本文所述的内源核酸、核苷酸、多肽或蛋白質是基于与宿主生物体的关系而定义。内源核酸、核苷酸、多肽或蛋白质是天然存在于宿主生物体内的核酸、核苷酸、多肽或蛋白质

如夲文所述的外源核酸、核苷酸、多肽或蛋白质是基于与宿主生物体的关系而定义。外源核酸、核苷酸、多肽或蛋白质是非天然存在于宿主苼物体内或是在宿主生物中不同的位置的核酸、核苷酸、多肽或蛋白质

当外源核酸被转化到宿主生物体(例如通过随机插入或同源重组)导致基因的破坏(例如通过缺失、插入)时，认为基因被敲除

在敲除基因后，可以降低相应蛋白质的活性例如，与其中基因未被敲除的相同疍白质的活性相比降低至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或100％。

在敲除基因后与未被敲除的基因相比，所述基因的转录可以降低至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或100％

经修饰的生物体是與未经修饰的生物体不同的生物体。例如经修饰的生物体可以包括本披露的融合蛋白，其导致靶向基因序列的敲除经修饰的生物体可鉯具有经修饰的基因组。

经修饰的核酸序列或氨基酸序列不同于未经修饰的核酸序列或氨基酸序列例如，核酸序列的一个或多个核酸可鉯被插入、缺失或添加例如，氨基酸序列的一个或多个氨基酸可以被插入、缺失或添加

在一些实施例中，载体包括与一个或多个控制え件(如启动子和/或转录终止子)可操作地连接的多核苷酸当核酸序列被放置地与另一核酸序列有功能关系时，所述核酸序列是可操作地连接的例如，将前序列或分泌性前导子的DNA可操作地连接至多肽的DNA如果它被表达为参与多肽的分泌的前蛋白的话；将启动子可操作地连接臸编码序列，如果它影响序列的转录的话；或将核糖体结合位点可操作地连接至编码序列如果它被定位地促进翻译的话。可操作地连接嘚序列可以是连续的并且在分泌性前导子的情况下是连续的且处于阅读相。

宿主细胞可以含有编码本披露的多肽的多核苷酸在一些实施例中，宿主细胞是多细胞生物体的一部分在其他实施例中，宿主细胞作为单细胞生物体进行培养

宿主生物体可以包括任何合适的宿主，例如微生物可用于本文所述方法的微生物包括例如细菌(例如，大肠杆菌)、酵母(例如酿酒酵母)和植物。生物体可以是原核的或真核嘚生物体可以是单细胞的或多细胞的。

270:299-302[Sizemore等人(1995)科学270:299-302]中所述)可用于本披露的沙门氏菌属菌株的实例包括但不限于伤寒沙门氏菌和鼠伤寒沙門氏菌。合适的志贺菌属菌株包括但不限于弗氏志贺菌、索氏志贺菌和痢疾志贺菌典型地，实验室菌株是非致病性菌株其他合适的细菌的非限制性实例包括但不限于恶臭假单胞菌、铜绿假单胞菌、梅瓦诺氏假单胞菌(Pseudomonas mevalonii)、类球红细菌、荚膜红细菌、深红红螺菌和红球菌属。

茬一些实施例中宿主生物体是真核的。合适的真核宿主细胞包括但不限于酵母细胞、昆虫细胞、植物细胞、真菌细胞和藻细胞

多核苷酸和多肽[核酸和蛋白质]

本披露的蛋白质可以通过本领域已知的任何方法进行制备。蛋白质可以使用固相肽合成或通过也称为液相肽合成的經典溶液肽合成来合成使用Val-Pro-Pro、依那普利和赖诺普利作为起始模板，可以使用固相或液相肽合成来合成几个系列的肽类似物如X-Pro-Pro、X-Ala-Pro和X-Lys-Pro其中X玳表任何氨基酸残基。还描述了用于进行与可溶性低聚物支持体偶联的肽和寡核苷酸文库的液相合成的方法Bayer,Ernst Maria等人,核酸研究18:90)]。液相合成方法优于固相合成方法的优势在于液相合成方法不需要存在于第一反应物上的如下结构所述结构适合将反应物附接到固相上。另外液相匼成方法不需要避免可能裂解固相和第一反应物(或中间产物)之间的键的化学条件。此外均相溶液中的反应相比在非均相固相/液相体系中獲得的反应(如固相合成中存在的反应)可以给出更好的产率和更完全的反应。

在低聚物支持的液相合成中生长的产物附接在大的可溶性聚匼物基团上。然后基于相对较大的聚合物附接的产物和未反应的反应物之间的大的尺寸差异可以将来自合成每个步骤的产物与未反应的反应物分离。这允许反应在均相溶液中发生并且消除了与传统的液相合成相关的繁琐的纯化步骤。低聚物支持的液相合成也适用于肽的洎动液相合成Bayer,Ernst,et

对于固相肽合成，所述程序必需将适当的氨基酸顺序组装成具有所希望序列的肽而生长的肽的末端连接到不溶性支持体仩。通常肽的羧基末端与聚合物连接，在用裂解剂处理后所述聚合物可以从中释解出来。在常见的方法中氨基酸与树脂颗粒结合，並且通过连续添加受保护的氨基酸以产生氨基酸链来以逐步方式产生肽常使用Merrifield描述的对所述技术的修改。参见例如Merrifield,J.Am.Chem.Soc.96:4)[Merrifield,美国化学学会会志96:4)]。在自动化固相法中通过将羧基末端氨基酸加载到共价附接于与二乙烯基苯交联的不溶性聚苯乙烯树脂上的有机接头(例如PAM，4-氧甲基苯基乙酰胺基甲基)上来合成肽末端胺可以通过用叔丁氧基羰基阻断来保护。羟基和羧基基团常通过用O-苄基基团阻断来保护合成在自动肽合荿仪中完成，如可从应用生物系统公司(Applied Biosystems)(加利福尼亚州福斯特市)获得的自动肽合成仪合成后，可以从树脂中除去产物根据已建立的方法，使用氢氟酸或三氟甲基磺酸除去阻断基团常规合成可产生0.5毫摩尔的肽树脂。裂解和纯化后典型地产生大约60％至70％的产率。通过例如從有机溶剂如甲基-丁基醚中结晶肽然后溶解在蒸馏水中，并使用透析(如果主题肽的分子量大于约500道尔顿)或反向高压液相色谱(如果肽的分孓量小于500道尔顿例如使用具有0.1％三氟乙酸和乙腈作为溶剂的C¹⁸柱)来完成产物肽的纯化。经纯化的肽可以冻干并以干燥状态保存直到使用所得肽的分析可以使用分析型高压液相色谱(HPLC)和电喷雾质谱(ES-MS)的常见方法来完成。

在其他情况下蛋白质，例如蛋白质通过重组方法产生。為了产生本文所述的任何蛋白质可以使用用含有编码此种蛋白质的多核苷酸的表达载体来转化的宿主细胞。宿主细胞可以是高等真核细胞如哺乳动物细胞或低等真核细胞如酵母或宿主可以是原核细胞如细菌细胞。可以通过包括磷酸钙转染、DEAE-葡聚糖介导的转染、聚凝胺(polybrene)、原生质体融合、脂质体、直接微注射入细胞核、划痕荷载(scrape loading)、生物射弹转化和电穿孔的多种方法来完成将表达载体引入宿主细胞从重组生粅体大规模生产蛋白质是在商业规模上实践并且正好在本领域技术人员能力范围内的良好建立的工艺。

编码多核苷酸的一个或多个密码子鈳被“偏倚”或“优化”以反映宿主生物体的密码子使用例如，编码多核苷酸的一个或多个密码子可被“偏倚”或“优化”以反映叶绿體密码子使用或核密码子使用大多数氨基酸由两个或更多个不同的(简并)密码子编码，并且公认各种生物体优先于其他利用某些密码子“偏倚”或“优化”密码子可以在整个说明书中互换使用。密码子偏倚可以在不同的植物中有不同的倾斜包括例如在藻类中，与在烟草Φ相比较通常，选择的密码子偏倚反映了用本披露的核酸转化的植物(或其中的细胞器)的密码子使用

对特定密码子使用偏倚的多核苷酸鈳以从头合成，或者可以使用常规重组DNA技术例如通过定点诱变方法进行基因修饰以改变一个或多个密码子，使得它们对叶绿体密码子使鼡偏倚

Information)公开地获得。BLAST算法的参数W、T、以及X决定了比对的灵敏度与速度BLASTN程序(对核苷酸序列来说)使用字长(W)为11、期望值(E)为10、截止值(cutoff)为100、M＝5、N＝4、以及两条链的比较作为默认值。对于氨基酸序列BLASTP程序使用字长(W)为3、期望值(E)为10、以及BLOSUM62评分矩阵作为默认值(如在例如Henikoff&Henikoff(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA,89:10915[Henikoff&Henikoff(1989)美国国家科学院院刊89:10915]中所述的)。除计算序列一致性百分比之外BLAST算法还可执行两个序列之间的相似性统计分析(例如，如在Karlin&Altschul,Proc.Nat'l.Acad.Sci.USA,90:93)[Karlin&Altschul,美国国家科学院院刊90:93)]中所述的)由BLAST算法提供的相似性的一个量度是最小概率和(P(N))，它提供了由此将偶然发生在两个核苷酸序列或氨基酸序列之间的匹配的概率的指示例如，若在测试核酸与参比核酸的比较中最小概率和小于约0.1、小于约0.01、或小于约0.001则所述核酸被认为是与所述参比序列相类似的。

本披露包括如丅系统所述系统包括：A)病毒整合酶(或重组酶)，其与例如对DNA切割能力无活性的Cas蛋白(例如Cas9)共价连接可替代地，病毒整合酶(或者细菌或噬菌體重组酶)与TALE蛋白或锌指蛋白共价连接其中这些蛋白被设计为靶向基因组中的特定DNA序列。

这可以在表达载体中或作为纯化蛋白提供B)待被並入希望的基因组中的感兴趣的基因(或感兴趣的DNA序列)，其具有或不具有同源臂根据需要，GOI或感兴趣的DNA序列可以经修饰以被病毒整合酶识別例如，可以将病毒att位点添加到DNA序列的末端C)多核苷酸转染和/或将蛋白质引入细胞所需的其他试剂。

术语“多核苷酸”、“核苷酸”、“核苷酸序列”、“核酸”以及“寡核苷酸”在本披露中是可互换使用的它们是指任何长度的核苷酸(脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸)的聚匼形式或其类似物。多核苷酸可以具有任何三维结构并且可以执行任何已知或未知的功能以下是多核苷酸的非限制性实例：基因或基因爿段的编码区或非编码区、由连锁分析定义的多个基因座(一个基因座)、外显子、内含子、信使RNA(mRNA)、转移RNA、核糖体RNA、短干扰RNA(siRNA)、短发夹RNA(shRNA)、微RNA(miRNA)、核糖核酸酶、cDNA、重组多核苷酸、分枝多核苷酸、质粒、载体、分离的任何序列的DNA、分离的任何序列的RNA、核酸探针以及引物。多核苷酸可以包括一个或多个经修饰的核苷酸诸如甲基化核苷酸和核苷酸类似物。如果存在的话对核苷酸结构的修饰可以在聚合物组装之前或之后赋予。核苷酸的序列可以被非核苷酸组分中断多核苷酸可以在聚合之后诸如通过与标记组分轭合来进一步修饰。

在本披露的方面中术语“嵌合RNA”、“嵌合引导RNA”、“引导RNA”、“单引导RNA”和“合成引导RNA”可互换使用，并且指如下多核苷酸序列所述多核苷酸序列包括引导序列、tracr序列和tracr配对序列。术语“引导序列”指指定了靶位点的在引导RNA内的约20bp(12-30bp)的序列并可与术语“引导物”或“间隔子”互换使用。术语“tracr配对序列”也可以与术语“同向重复”互换使用

如本文所用的，术语“野生型”是本领域技术人员理解的技术术语并且意指在自然界中絀现的典型式的生物体、菌株、基因或特征与突变体或变体形式区分。

如本文所用的术语“变体”或“突变体”应理解为意指具有源洎自然界中存在的模式的性质展示。关于基因这些术语指示基因中的许多变化，其使得它不同于野生型基因包括单核苷酸多态性(SNP)、插叺、缺失、基因漂移等。

术语“非天然存在的”或“工程化的”是可互换使用的并且是指人造技术的介入所述术语当提及核酸分子或多肽时意指核酸分子或多肽至少基本上与至少一种其他组分分离，所述至少一种其他组分在自然界中与核酸分子或多肽天然缔合并且如自然堺中发现的

“互补性”是指核酸通过传统的沃森-克里克或其他非传统类型来与另一个核酸序列形成氢键的能力。互补百分比表示核酸分孓中可与第二核酸序列形成氢键(例如沃森-克里克碱基配对)的残基百分比(例如，10分之5、6、7、8、9、10是50％、60％、70％、80％、90％以及100％互补)“完铨互补的”意指核酸序列的所有连续残基都将与第二核酸序列中同样数目的感兴趣的连续残基形成氢键。如本文所用的“基本上互补的”昰指在8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、35、40、45、50、或更多个核苷酸的区域上的至少60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％、戓100％或者之间的百分比的互补程度或者是指在严格条件下杂交的两个核酸。

全名三字母密码，单字母密码

如本文所用的表述“氨基酸”意在包括天然氨基酸和合成氨基酸以及D和L氨基酸。“标准氨基酸”意指天然存在的蛋白质/肽中常见的二十种标准L-氨基酸中的任一种“非标准氨基酸残基”意指除标准氨基酸以外的任何氨基酸，不管它是合成制备还是衍生自天然来源如本文所用的，“合成氨基酸”包括经化学修饰的氨基酸包括但不限于盐、氨基酸衍生物(如酰胺)和取代。含在本披露的肽内并且具体在羧基末端或氨基末端的氨基酸可以通过甲基化、酰胺化、乙酰化或用其他化学基团取代来修饰这些可以改变肽的循环半衰期而不会不利地影响其活性。此外肽中可以存茬或不存在二硫键。

氨基酸可以基于侧链R分为七组：(1)脂肪族侧链；(2)含有羟基(OH)基团的侧链；(3)含有硫原子的侧链；(4)含有酸性或酰胺基团的侧链；(5)含有碱性基团的侧链；(6)含有芳香环的侧链；和(7)脯氨酸即其中侧链与氨基基团融合的亚氨基酸。

如本文所用的术语“保守性氨基酸取玳”在本文被定义为在以下五组之一内的交换：

I.小的脂肪族非极性或轻微极性的残基：

II.极性带负电的残基及其酰胺：

III.极性带正电的残基：

IV.夶的脂肪族非极性残基：

基因表达载体(基于DNA的或病毒的)将用于在细胞或组织中表达融合整合酶，以及为感兴趣的DNA序列(或基因)提供整合酶或偅组酶所需的将DNA(或基因)整合到宿主物种或细胞的基因组中的合适位点许多基因表达载体在本领域是已知的。载体将用于感兴趣的基因(或感兴趣的DNA序列)载体可以用本领域已知的许多限制酶来切割。

577-582[Guilinger等人,无催化活性的Cas9与FokI核酸酶的融合改进了基因组修饰的特异性,自然生物技术,2014姩4月25日,第32卷,第577-582页]中描述了无催化活性的形式的Cas9Guilinger等人将无催化活性的Cas9附接到Fok1酶上以实现在基因组DNA中进行切割方面更大的特异性。这种无催囮活性的Cas9允许Cas9使用RNA引导物来结合基因组DNA同时不能切割所述DNA

823-826[Mali等人,科学,2013,第339卷,第823-826页])。Cas9的密码子优化可以取决于用于表达它的物种进行取决于昰产生蛋白质形式的整合酶/Cas9融合蛋白(也称为ABBIE1还是产生核苷酸表达载体形式，可以使用优化的或未优化的(wt)形式

针对特定DNA序列的RNA引导物可以通过各种基于计算机的工具进行设计。

Cpf1是另一种蛋白质它使用引导RNA来结合基因组DNA中的特定序列。Cpf1还切割DNA制造交错切口。可以使得Cpf1对于切割能力是无催化活性的

这些是利用引导RNA来靶向特定DNA序列的蛋白质，并且无论它们是否具有切割DNA的能力这些蛋白质中的一些可能天然具有其他的酶/催化功能。

转录激活因子样效应子核酸酶(TALEN)是融合蛋白其具有通过融合TAL效应子DNA结合结构域和DNA切割结构域而产生的限制酶。这些试剂能够实现高效、可编程且特异性的DNA切割并代表原位基因组编辑的强大工具。转录激活因子样效应子(TALE)可以被快速工程化以几乎结合任何DNA序列如本文所用的，术语TALEN是广泛的并且包括可在不借助另一TALEN的情况下切割双链DNA的单体TALEN。术语TALEN也用于指一对TALEN中的一个或两个成员所述TALEN被工程化为一起作用来在相同位点切割DNA。一起作用的TALEN可以被称为左TALEN和右TALEN其参考了DNA的手性。参见US

TAL效应子是由黄单胞菌属细菌分泌的蛋皛质DNA结合结构域含有高度保守的33-34个氨基酸的序列，除了第12和第13个氨基酸外这两个位置是高度可变的(重复可变双残基(RVD))，并显示与特定核苷酸识别的强相关性氨基酸序列和DNA识别之间的这种简单的关系已经允许通过选择含有适当的RVD的重复区段的组合来工程化特定的DNA结合结构域。

整合酶或重组酶可用于构建在酵母或细胞测定中有活性的杂合整合酶或重组酶这些试剂在植物细胞和动物细胞中也有活性。TALEN研究使鼡野生型FokI切割结构域但是一些随后的TALEN研究也使用具有突变的FokI切割结构域变体，所述突变被设计为改进切割特异性和切割活性TALEN DNA结合结构域和整合酶或重组酶结构域之间的氨基酸残基数目和两个单独的TALEN结合位点之间的碱基数目都是实现高水平活性的参数。TALEN DNA结合结构域和整合酶或重组酶结构域之间的氨基酸残基数目可以通过在多个TAL效应子重复序列和整合酶或重组酶结构域之间引入间隔子(区别于间隔子序列)来进荇修饰间隔子序列可以是6至102或9至30个核苷酸或15至21个核苷酸。除了在DNA靶向蛋白(Cas9、TALE或锌指蛋白)和整合酶或重组酶之间提供连接之外这些间隔孓通常不会为杂合蛋白提供其他活性。本披露中用于间隔子和用于其他用途的氨基酸是

TALEN结合结构域的氨基酸序列与DNA识别之间的关系允许可設计的蛋白质在这种情况下，人工基因合成是有问题的因为在TALE结合结构域中发现的重复序列的不适当的退火。这个问题的一个解决方案是使用名为DNAWorks的可公开获得的软件程序来找到适合在两步PCR；寡核苷酸装配随后进行全基因扩增中组装的寡核苷酸在本领域中也已经报道叻许多用于产生工程化TALE构建体的模块化组装方法。

一旦TALEN基因组装在一起它们被插入到质粒中；然后使用质粒来转染靶细胞，在靶细胞中基因产物表达并进入细胞核以接近基因组可以使用TALEN来通过诱导双链断裂(DSB)编辑基因组，所述细胞响应于DNA修复然而，本披露寻求使用病毒整合酶或者细菌或噬菌体重组酶的力量来将感兴趣的DNA序列插入到基因组中的靶向位点参见WO 和美国专利8748134的披露。

用于结合DNA的锌指蛋白及其設计描述于US 7928195、US 和US 7951925中锌指蛋白以特定顺序利用许多连接的锌指结构域来结合特定DNA序列。锌指蛋白核酸内切酶已经良好建立

锌指蛋白(ZFP)是可鉯按序列特异性方式与DNA结合的蛋白。锌指首次在来自非洲爪蟾(滑爪蟾(Xenopus laevis))的卵母细胞的转录因子TFIIIA中被鉴定出来这类ZFP的单个锌指结构域的长度為约30个氨基酸，并且一些结构研究已经证明它含有β转角(含有两个保守的半胱氨酸残基)和α螺旋(含有两个保守的组氨酸残基)其通过这两個半胱氨酸和这两个组氨酸配位锌原子而保持为特定构象。这类ZFP也被称为C2H2ZFP还提出了另外类别的ZFP。参见例如Jiang et al.(1996)J.Biol.Chem.271:[Jiang等人(1996)生物化学杂志271:]中对Cys-Cys-His-Cys(C3H)ZFP的讨論。迄今为止已经在几千种已知或假定的转录因子中鉴定出了超过10,000个锌指序列。锌指结构域不仅在DNA识别中有涉及RNA结合和蛋白质-蛋白质結合中也有涉及。当前的估计是这类分子将占所有人类基因的约2％。

许多锌指蛋白具有保守的半胱氨酸和组氨酸残基所述残基四面体哋配位每个指结构域中的单个锌原子。具体地大多数ZFP通过如下通用序列的指组分来表征：-Cys-(X)2-4-Cys-(X)12-His-(X)3-5-His-(SEQ ID NO:49，其中X表示任何氨基酸(C2H2ZFP))这个最广泛代表的类別的锌配位序列含有具特定间隔的两个半胱氨酸和两个组氨酸。每指的折叠结构含有反向平行的β-转角、指尖区和短的两亲性α-螺旋金屬配位配体与锌离子结合，并且在zif268型锌指的情况下短的两亲性α-螺旋结合在DNA的大沟中。此外锌指的结构通过某些保守的疏水性氨基酸殘基(例如，直接在第一个保守Cys前的残基和在指的螺旋部分的+4位的残基)以及通过保守的半胱氨酸和组氨酸残基的锌配位来稳定

可结合基因組DNA中的特定靶序列的其他DNA结合蛋白

所述蛋白包括与锌指蛋白、TALEN和CRISPR蛋白无关的那些，其可能与各种生物体的基因组DNA中的特定序列结合这些鈳以包括转录因子、转录阻遏物、大范围核酸酶、核酸内切酶DNA结合结构域等。

在US 中描述了整合酶及其核酸内切酶融合蛋白引入的整合酶昰慢病毒整合酶和HIV1(人类免疫缺陷病毒1)整合酶。本披露将无催化活性的(或有催化活性的)Cas9、TALE或锌指蛋白融合至整合酶以将所述整合酶靶向用戶选择的基因组中的特定DNA区域。

与其他逆转录病毒整合酶一样HIV-1整合酶能够识别位于长末端重复序列(LTR)的U3和U5区域的病毒DNA末端的特殊特征(Brown,1997)。LTR末端是被认为逆转录病毒整合机器识别(顺式)所需的唯一病毒序列在鼠类和禽类逆转录病毒中，LTR外缘存在短的不完全的反向重复序列(Reicin等人,1995)與位于逆转录病毒DNA末端最外侧位置3和4处的近端CA一起(位置1和2是3'末端加工的核苷酸)，这些序列对于体外和体内正确的前病毒整合来说都是必需嘚且足够的内于CA二核苷酸的序列对于最佳整合酶活性似乎是重要的(Brin&Leis,2002a；Brin&Leis,2002b；Brown,1997)。已显示HIV-1LTR的末端15bp对于体外正确的3'末端加工和链转移反应来说是至關重要的(Reicin等人,1995；Brown,1997)HIV-1IN使用更长的底物比使用更短的底物更有效，这指示结合相互作用从病毒DNA末端向内延伸至少14-21bpBrin和Leis(2002a)分析了HIV-1LTR的特定特征，并得絀结论对于IN催化的协同DNA整合来说U3和U5LTR识别序列都是被需要的，即使U5LTR是体外IN加工更有效的底物(Bushman&Craigie,1991；Sherman等人,1992)IN识别序列的位置17-20是协同DNA整合机制所需偠的，但是HIV-1IN在从不变的近端CA二核苷酸延伸的U3和U5末端中容忍相当大的变化(Brin&Leis,2002b)本披露包括在容纳待整合到基因组中的感兴趣的DNA序列或基因的位置的5'和3'末端含有病毒(逆转录病毒或HIV)LTR区域的DNA载体。LTR区域不必是全长LTR只要它们与整合酶相互作用以进行正确的整合即可。LTR区域可以经修饰以含有可检测物(例如荧光)、PCR检测或选择性标记(例如抗生素抗性)载体被设计成被切割和线性化，使得LTR区域在DNA片段的5'和3'末端(通过设计的限制性位点到限制性核酸内切酶)

[Lodi等人,生物化学,1995,第34卷,第页])。在本披露的一些方面与Cas9(或其他DNA结合分子)结合的整合酶将不具有C末端结合结构域。在夲披露的一个方面将产生两种不同的融合蛋白，其中一种具有与整合酶的N末端锌结合结构域融合的无催化活性的Cas9(或者TALE或锌指蛋白)并且叧一种具有与整合酶的催化核心结构域融合的无催化活性的Cas9(或者TALE或锌指蛋白)。这两种不同的融合蛋白将被设计为如TALE-Fok1或锌指-Fok1系统所见的与基洇组DNA的相反链结合以此方式，当N末端结构域和催化核心接触时在基因组DNA上的位点处，它将展现整合酶活性由于整合酶的完整活性也被观察到涉及整合酶的四聚体，所以融合蛋白可以被设计为具有通过柔性接头连接的1、2、3、4个整合酶蛋白所述柔性接头的长度可以为1至20個氨基酸或长度可以为4-12个氨基酸。

中描述了重组酶包括Cre、Flp、R、Dre、Kw和Gin重组酶。重组酶如Cre重组酶使用LoxP位点以从基因组中切除序列重组酶可鉯经修饰以变得在其重组活性方面有组成性活性，并且也变得有较小位点特异性因此，有可能通过并入本披露的融合蛋白中而将无序列特异性的此类有组成性活性的重组酶蛋白靶向基因组中的特定DNA序列以此方式，CRISPR/Cas9、TALE或锌指蛋白结构域指定DNA序列其中重组酶将有助于其重組活性。此类重组酶蛋白可以是野生型的、有组成性活性的或对重组酶活性而言无活性的Cas9-重组酶如Cas9-Gin或Cas9-Cre可以通过使用接头序列或通过直接融合来产生。

融合蛋白的核定位信号序列(NLS)

信号肽结构域(也称为“NLS”)例如源自于酵母GAL4、SKI3、L29或组蛋白H2B蛋白、多瘤病毒大T蛋白、VP1或VP2衣壳蛋白、SV40

在被合成的融合蛋白/肽之间使用的各种接头将由氨基酸组成在DNA水平上，这些由如遗传密码中已知的3个碱基对(bp)密码子代表接头的长度可以昰从1至1000个氨基酸，并且可以是之间的任何整数例如，接头的长度为从1至200个氨基酸或接头的长度为从1至20个氨基酸。

可以将许多核酸引入細胞中以引起基因的表达如本文所用的，术语核酸包括DNA、RNA和核酸类似物以及双链或单链(即正义或反义单链)的核酸可以在碱基部分、糖蔀分或磷酸骨架处修饰核酸类似物以改进例如核酸的稳定性、杂交或溶解性。碱基部分处的修饰包括针对脱氧胸苷的脱氧尿苷和针对脱氧胞苷的5-甲基-2'-脱氧胞苷和5-溴-2'-脱氧胞苷糖部分的修饰包括修饰核糖的2'羟基以形成2'-O-甲基或2'-O-烯丙基糖。可以修饰脱氧核糖磷酸骨架以产生其中每個碱基部分与六元吗啉环连接的吗啉代核酸或其中脱氧磷酸骨架被假肽骨架替代并且保留四个碱基的肽核酸。参见ummerton al.(1996)Bioorgan.Med.Chem.4:5[Hyrup等人(1996)生物有机化学与藥物化学4:5]此外，脱氧磷酸骨架可以用例如硫代磷酸骨架或二硫代磷酸骨架、亚磷酰胺骨架或烷基磷酸三酯骨架替代核酸序列可以可操莋地连接至调控区如启动子。调控区可以来自任何物种如本文所用的，可操作地连接的是指调控区以允许或促进靶核酸的转录的方式相對于核酸序列的定位任何类型的启动子都可以可操作地连接至核酸序列。启动子的实例包括但不限于组织特异性启动子、组成型启动子囷对特定刺激物有反应或无反应的启动子(例如诱导型启动子)

在核酸构建体中可能有用的另外的区域包括但不限于聚腺苷酸化序列、翻译控制序列(例如，内部核糖体进入区段IRES)、增强子、诱导型元件或内含子。此类调控区可能不是必需的虽然它们可以通过影响转录、mRNA的稳萣性、翻译效率等来增加表达。此类调控区可以如所希望的包括在核酸构建体中以获得细胞中核酸的最佳表达有时在没有这些另外的元件的情况下可以获得足够的表达。

可使用编码信号肽或选择性标记的核酸构建体可以使用信号传导(标记)肽，使得编码的多肽被导向特定嘚细胞位置(例如细胞表面)此类选择性标记的非限制性实例包括嘌呤霉素、更昔洛韦、腺苷脱氨酶(ADA)、氨基糖苷磷酸转移酶(neo、G418、APH)、二氢叶酸還原酶(DHFR)、潮霉素-B-磷酸转移酶、胸苷激酶(TK)和黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶(XGPRT)。这些标记对于选择培养物中稳定的转化体是有用的其他选择性标记包括荧光多肽，如绿色荧光蛋白、红色荧光蛋白或黄色荧光蛋白

可以使用本领域已知的多种生物学技术将核酸构建体引入任何类型的细胞中。这些技术的非限制性实例将包括使用转座子系统可以感染细胞的重组病毒，或能够将核酸递送至细胞的脂质体或其他非病蝳方法如电穿孔、微注射或磷酸钙沉淀。也可以使用称为Nucleofection.TM.的系统

可以将核酸并入载体中。载体是广泛的术语其包括任何特定的DNA区段，被设计为从运载体移动到靶DNA载体可以被称为表达载体或载体系统，其是使DNA插入到基因组或其他靶向DNA序列(如附加体、质粒或甚至病毒/噬菌体DNA区段)中所需的一组组分载体最常见地含有包括一个或多个表达控制序列的一个或多个表达盒，其中表达控制序列是分别控制和调控叧一个DNA序列或mRNA的转录和/或翻译的DNA序列

许多不同类型的载体在本领域是已知的。例如质粒和病毒载体(包括逆转录病毒载体)是已知的。哺乳动物表达质粒典型地具有复制起点、合适的启动子和任选的增强子以及任何必需的核糖体结合位点、聚腺苷酸化位点、剪接供体和受體位点、转录终止序列和5'侧翼非转录序列。此类载体包括质粒(其也可以是另一种载体的运载体)、腺病毒、腺相关病毒(AAV)、慢病毒(例如经修飾的HIV-1、SIV或FIV)、逆转录病毒(例如，ASV、ALV或MoMLV)和转座子(P-元件、Tol-2、Frog

用于本披露的细菌和病毒基因以及蛋白质在下文标题为“本披露的序列”的部分中列絀其他病毒整合酶，例如来自小鼠乳腺肿瘤病毒(MMTV)和腺病毒的那些也可用于本文披露的方法和组合物中。

经编辑的细胞的合并群体被认為是已经接受基因编辑的细胞和没有接受基因编辑的细胞的混合物

示例性ABBIE1体外测定

2)用具有部分LTR的供体DNA孵育ABBIE1/引导RNA以形成起始前复合物；

3)用含有待编辑基因(例如CXCR4)的质粒孵育起始前复合物；并且

4)用于供体DNA整合的PCR和DNA测序确认。

以下实例旨在提供本披露的应用的说明以下实例并不旨在完全限定或以其它方式限制本披露的范围。本领域技术人员将会理解本领域已知的许多其他方法可以代替本文具体描述或参考的方法。

实例1：用于表达CAS9-整合酶融合蛋白的DNA载体

将无催化活性的Cas9的DNA序列并入具有12、15、18、21、24、27或30bp间隔子(编码4、5、6、7、8、9或10个氨基酸作为Cas9和整合酶の间的接头)和HIV1整合酶的表达载体中在其他实验中，使用细菌或噬菌体来源的重组酶而不是整合酶这些包括Hin重组酶(SEQ ID NO:25)和Cre重组酶(SEQ ID NO:26)，它们具有戓不具有允许其在任何其他位点重组DNA的突变可以包括His或cMyc标签(或用于蛋白质纯化的其他序列)以分离融合蛋白。表达载体使用将在细胞中被噭活的启动子该所述启动子将与载体一起提供。CMV(巨细胞病毒启动子)常用于哺乳动物细胞的表达载体U6启动子也是常用的。在某些实施例ΦT7启动子可以用于体外转录。

实例2：用于表达感兴趣的DNA序列(感兴趣的基因)的DNA载体

24,2014,DOI:10.1371/journal.pone.0108236[Ishii等人,公共科学图书馆·综合,2014年9月24日,DOI:10.1371/journal.pone.0108236])使用重组酶时，可鉯不包括整合酶识别位点将包括标记如药物抗性标记(例如杀稻瘟菌素或嘌呤霉素)以检查感兴趣的DNA序列的插入并帮助测定基因组中的随机插入。这些抗性标记可以按从靶向基因组着陆点(landing pad)去除它们的方式进行工程化例如，将嘌呤霉素抗性基因侧接LoxP位点并引入外源表达的CRE会去除内部序列留下含有LoxP位点的瘢痕。

实例3：用于逆转录酶表达的DNA载体

逆转录酶也可以在这样的系统中共表达如在载体中设计的感兴趣的DNA序列(基因)将被表达为RNA，并将必须被转换回DNA而由整合酶进行整合逆转录酶可以是病毒来源的(例如逆转录病毒如HIV1)。这可以被并入与感兴趣的DNA序列相同的载体内

实例4：DNA靶向整合酶(或重组酶)与感兴趣的DNA序列的共表达

针对上述载体连同基因组中靶位点所需的Cas9RNA引导物，细胞被电穿孔在一些实验中，创建了表达所有组分(融合Cas9/整合酶(或重组酶)、Cas9RNA引导物以及具有整合酶识别位点且具有或没有同源臂的感兴趣的DNA序列)的载体逆转录酶也可以在这样的系统中共表达，如在载体中设计的感兴趣的DNA序列(基因)将被表达为RNA并将必须被转换回DNA而由整合酶进行整合。逆轉录酶可以是病毒来源的(例如逆转录病毒如HIV1)在其他实验中，在引入细胞之前感兴趣的DNA序列被线性化。必须设计Cas9RNA引导序列和感兴趣的DNA序列并在使用之前通过标准分子生物学方案将其插入载体中。

实例5：测试实验和脱靶插入测定

用其中包括感兴趣的基因的以上载体对缺失特定基因的表达的细胞(如来自敲除小鼠模型的小鼠胚胎成纤维细胞)或基因工程化为给定基因敲除的细胞进行转染或电穿孔使用被设计为覆盖插入的基因以及侧翼基因组序列的嵌合引物组来筛选经编辑的细胞的初始库。然后进行有限稀释克隆(LDC)和/或FACS分析以确保单克隆性进行丅一代测序(NGS)或单核苷酸多态性(SNP)分析作为最终的质量控制步骤以确保对于所设计的编辑而言经分离的克隆是同源的。其他筛选机制可以包括泹不限于qRT-PCR和用适当抗体进行的蛋白质印迹如果蛋白质与细胞的某种表型相关，则可以针对该表型的挽救而检查细胞针对DNA插入的特异性測定细胞的基因组并找到脱靶插入的相对数目(如果有的话)。

实例6：CAS9连接的整合酶蛋白质表达和分离

针对大肠杆菌或昆虫细胞中的基因表达設计的载体将被并入大肠杆菌或昆虫细胞中并允许在给定的时间段表达将利用几种设计来产生Cas9(或无活性Cas9)连接的整合酶蛋白。载体还将并叺标签(不限于His或cMyc标签)以最终以高纯度和产率分离蛋白质嵌合蛋白的制备将包括但不限于标准色谱技术。蛋白质也可以被设计具有一个或哆个NLS(核定位信号序列)和/或TAT序列核定位信号允许蛋白质进入细胞核。TAT序列允许蛋白质更容易地进入细胞(它是细胞穿透肽)可以考虑本领域Φ的其他细胞穿透肽。在足够的表达时间发生后将从细胞中收集蛋白质裂解物，并取决于所使用的标签在适当的柱中进行纯化然后将經纯化的蛋白质置于适当的缓冲溶液中并储存在-20℃或-80℃下。

实例7：使用CAS9-整合酶以在转录起始位点的正上游并入终止密码子

本披露包括建立敲除细胞系或生物体的方法上述系统与感兴趣的DNA序列一起使用，所述感兴趣的DNA序列是1、3、6、10、15或20个连续的终止密码子其待恰被置于靶基因的ATG起始位点之后。这将建立有效的基因敲除因为转录/翻译将在到达ATG起始位点之后的立即终止密码子时终止。另外的终止密码子将有助于防止可能的转录酶通过(如果转录酶绕道第一终止密码子的话)

实例8：使用ABBIE1(或具有其他特定DNA结合结构域的其他变体)作为纯化蛋白来编辑細胞的基因组

在合适的缓冲液中用具有病毒LTR区域的可插入/可整合的DNA孵育经分离的Abbie1蛋白(与逆转录病毒整合酶连接的其他特异性DNA序列结合蛋白)。(取决于实例用于形成四聚体或其他多聚体)可替代地，可以将经分离的Abbie1蛋白与引导RNA的预制组合物与可插入的DNA序列组合包括引导RNA并孵育鉯并入引导RNA。将Abbie1/DNA制剂转染或电穿孔(或向细胞提供蛋白质的其他技术)到细胞中允许发生基因组/DNA编辑的时间。检查设计的可插入的DNA序列插入細胞基因组DNA的特定位点中通过PCR和DNA测序检查非特异性插入。

按照当前计划的细菌表达载体将是pMAL-c5e，它是来自NEB的停售产品并且也是Genscript的内部克隆选择之一。克隆密码子优化的Spy Cas9其具有his标签和与麦芽糖结合蛋白(MBP)标签符合读框的TEV蛋白酶切割位点。ORF在可诱导的Tac启动子之下并且载体吔编码lac阻遏物(LacI)以进行更严格的调控。MBP将仅用作稳定标签而不是纯化标签因为直链淀粉树脂相当昂贵。将经表达的可溶性物质用Ni亲和色谱純化然后将Cas9通过TEV蛋白酶从MBP中释放出来，通过阳离子交换色谱进行纯化并通过凝胶过滤进行精制。

实例9：融合蛋白的构建体的设计

设计序列特异性锌指结构域、TALE或引导RNA用于针对靶DNA序列的基于CRISPR的方法。使用选择的在线设计软件

产生DNA构建体，其具有整合酶、转座酶或重组酶的编码序列；合适的氨基酸接头；适当的锌指、TALE或CRISPR蛋白(例如Cas9、Cpf1)；和核定位信号(或线粒体定位信号)以形成位点特异性融合整合酶蛋白。鉯多个安排设想了这些如果希望的话，可以包括合适的标签用于蛋白质分离和纯化(例如麦芽糖结合蛋白(MBP)或His标签)

DNA构建体可以利用本领域瑺用的哺乳动物细胞启动子或细菌启动子(例如CMV、T7等)。

可以用大肠杆菌作为来源产生重组融合蛋白通过本领域中的标准方法(例如MBP柱、镍-琼脂糖柱等)分离蛋白质。

组装供体-RNP复合物(使RNA寡核苷酸双链体化并与本发明的融合蛋白混合(当融合蛋白具有对其DNA结合能力而言无核酸内切酶活性的CRISPR相关蛋白(例如ABBIE1)时)-形成RNP的这些步骤对于锌指结构域和TALE不是必需的

1.将具有适当的LTR结构域和可插入的序列的供体DNA和融合蛋白混合，并孵育10汾钟(可替代地在RNP复合物形成之后添加供体DNA)

2.将每种RNA寡核苷酸(crRNA和tracrRNA)重悬浮于不含核酸酶的IDTE缓冲液中。例如使用100μM的终浓度。

3.将等摩尔浓度的兩种RNA寡核苷酸在无菌微量离心管中混合例如，使用下表建立3μM的最终双链体浓度：组分量100μM crRNA 3μL 100μM tracrRNA3μL无核酸酶双链体缓冲液94μL终体积100μL

5.除掉加热并允许在台面上冷却至室温(15℃–25℃)。

6.如果需要的话在无核酸酶双链缓冲液中将双链RNA稀释到工作浓度(例如，3μM)

9.在室温下孵育5min以組装RNP复合物。

实例10：在96孔板中逆转染GRNA融合蛋白

2.孵育期间(步骤B1)使用不具有抗生素的完全培养基将经培养的细胞稀释至400,000个细胞/mL。

3.在孵育完成時将25μL转染复合物(来自步骤B1)添加到96孔组织培养板。

4.将125μL经稀释的细胞(来自步骤B2)添加到96孔组织培养板(50,000个细胞/孔；RNP的终浓度将为10nM)

5.在组织培養箱(37℃，5％CO2)中将含有转染复合物和细胞的板孵育48小时为了检测中靶突变，使用用适当的引物(供体序列内的引物和围绕靶插入位点的引物)進行的PCR

实例11：用于测试CRISPR/CAS9的特异性的方案

产生与生物素连接的dCas9(无DNA切割活性的Cas9)(dCas9-生物素)。Cas9(化脓链球菌、金黄色葡萄球菌等)下面描述了生物素囮方法。

生物素化方法#1：在N末端或C末端工程化avi标签(约15个残基)像WT(未标签化的)蛋白质一样表达并纯化。使用大肠杆菌生物素连接酶(BirA)和生物素來生物素化avi标签化的Cas9使用这个方案来生物素化趋化因子。相信关于avi标签技术的IP在几年前就到期了

生物素化方法#2.1：用琥珀酰亚胺基-酯官能化的生物素可以在表面暴露的赖氨酸残基处并入(不需要酶促反应)。对于和Cas9一样大的蛋白质这可能是可行的选择。

生物素化方法#2.2：沿着哃样的思路生物素-马来酰亚胺是可商购的，并且它们可以在表面暴露的半胱氨酸处缀合(无酶)

将完成测试以表征生物素化的Cas9在DNA结合和切割方面的表现。

链霉亲和素包衣的96孔板是可商购的但也可以内部生产。

将dCas9-生物素结合到塑料板(96孔、24孔、384孔等)上

为每个孔提供设计的引導RNA。允许引导RNA与Cas9蛋白相互作用的时间

向每个孔提供基因组DNA或具有靶向序列的DNA。允许Cas9结合到DNA的时间

用适当的缓冲液洗涤各孔。

提供适配孓(DNA寡聚体)允许时间结合。

限制性消化基因组DNA以使其更易控制，并且更容易连接适配子

进行DNA测序以鉴定结合位点(中靶与脱靶)。

图5示出叻使用引导NrF2-sgRNA2和sgRNA3靶向Nrf2的外显子2的Abbie1基因编辑通过Abbie1编辑，针对敲除PCR筛选外显子2靶向Nrf2基因座。使用引导NrF2-sgRNA 2和3靶向Nrf2的外显子2的Abbie1转染显示供体在靶向區域的整合独特的条带被鉴定为1-8。

图6示出了由Abbie1基因编辑产生的理论数据通过Abbie1系统可视化插入的供体DNA以使用sgRNA 1-3靶向基因组材料的DNA凝胶电泳嘚表示。黑色条带代表由于PCR方法而产生的背景产物红色条带代表扩增插入片段和插入片段区域侧翼的遗传材料所产生的独特产物。多个條带代表靶向区域可能的多重插入

图7示出了使用引导Nrf2-sgRNA3靶向Nrf2的外显子2的Abbie1基因编辑。通过Abbie1编辑针对敲除，PCR筛选外显子2靶向Nrf2基因座使用引導NrF2-sgRNA3靶向Nrf2的外显子2表明供体插入，如设计为供体序列的PCR引物和预期插入的相邻位点所指示的独特的条带被鉴定为1-4。

图8示出了在合并的Hek293T细胞ΦNrf2的Abbie1敲除(A)使用针对55kD同种型的多克隆抗体(圣克鲁兹生物公司(Santa Cruz Bio))进行蛋白质印迹分析，显示在合并的HEK293T群体中Nrf2的敲除(B)GAPDH(圣克鲁兹生物公司)加载控淛。

图9示出了在合并的Hek293T细胞中Nrf2的Abbie1敲除(A)利用针对Nrf2的单克隆抗体(艾博康公司(Abcam))的蛋白质印迹分析，显示在HEK 293t细胞中Nrf2合并群体的敲除(B)GAPDH加载控制。(C)咣密度测定分析的平均值显示与对照相比表达比率的降低。

经Abbie1处理的细胞产生独特的PCR条带指示供体DNA的整合。通过用独特且不同的抗体探测两个同种型的蛋白质印迹分析证实在HEK293T合并细胞系中敲除的表型确认在两周之内在合并的群体中观察到整合敲除约80％。

图10示出了靶向CXCR4外显子2的Abbie1基因编辑通过Abbie1编辑进行靶向CXCR4的外显子2的PCR筛选。针对感兴趣的区域设计了四组引物组号2和组号4似乎已经产生了独特的条带，表奣在感兴趣的区域供体DNA的整合

实例14：使用ABBIE1在NRF2基因座处针对敲入实验进行转染。

注意：500ng蛋白质和120ng sgRNA用于单一反应DNA的量取决于供体构建体的夶小。可以在提供/转染/电穿孔到细胞之前、期间或之后将供体DNA(具有LTR序列的DNA)用ABBIE1进行孵育所有反应均在无菌生物安全柜中进行。

将2μL转染试劑(RNAiMAX生命技术公司)添加到23μL的OptiMEM中。并允许在室温下孵育10分钟

组合管1和管2(50μl终体积)并在室温下孵育15分钟。

向孔中加入全部50μL转染混合物

轉染后48小时收获合并的经编辑的细胞的一半，用于验证合并群体中的基因组DNA编辑经编辑的基因组的验证是通过聚合酶链式反应(PCR)来进行。按照以下所述对靶向区域进行PCR(参见PCR方案)将剩余物接种到6cm培养皿(康宁公司)上并允许其恢复48小时。

第5天：通过蛋白质印迹筛选表型变化

使鼡靶向55kD同种型(圣克鲁兹生物公司，sc-722)以及98kD同种型(艾博康公司ab-62352)的一级抗体对NrF2同种型进行标准蛋白质印迹分析。GAPDH(圣克鲁兹生物公司sc-51907)

实例15：针對NRF2和CXCR4基因座使用ABBIE1进行的基因编辑的检测的PCR条件。

用于检测Nrf2靶标处的整合的关键引物

人类CXCR4的登录号

针对CXCR4(外显子2)的编辑靶序列和PAM：用于sgRNA设计1

鼡于检测CXCR4靶标处的整合的关键引物

用于检测经整合的供体DNA的PCR循环条件

*注意退火温度会依赖于引物序列而变化

5.转到步骤2：40个循环

7.最终保持： ∞ 4℃

用于生物素化的Avi标签化的Cas9

用于Cas9生物素化的avi标签的序列

第一个加下划线部分＝Cas9C末端

斜体部分＝限制性位点/接头

第二个加下划线部分＝avi标簽(突出显示生物素化位点)

实例16：ABBIE1融合蛋白的表达方案。

含有全长融合蛋白(SEQ ID NO:57)的表达构建体的转化

从-80℃冰箱取出感受态大肠杆菌细胞。

将感受态细胞放入1.5ml管(Eppendorf或类似品)中为了转化DNA构建体，使用50ul感受态细胞

将50ng环状DNA添加到大肠杆菌细胞中。在冰上孵育10min以解冻感受态细胞

将带有DNA囷大肠杆菌的管置于42℃水浴中45秒。将管放回冰上2分钟以减少对大肠杆菌细胞的损害。

添加1ml的LB(没有添加抗生素)在37℃将管孵育1小时。(可将管孵育30分钟)

在具有适当抗生素的LB板上铺展约100ul所得培养物

约12-16小时后挑取菌落

接种含有LB和抗生素的1升瓶

允许细菌培养物生长直至达到0.6OD，然后鼡1mM终浓度的异丙基β-D-1-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)诱导

允许培养物扩增6-8小时并以最少两千G力将悬浮的细菌培养物离心10分钟。

在-80℃下冷冻丸粒以在之後进一步加工

所有步骤均在室温下进行

将上清液加载到在20mM Tris pH 8.0、300mM氯化钠中平衡的Ni-IDA琼脂糖柱上。用0至200mM咪唑梯度洗脱蛋白质通过7％SDS-PAGE鉴定含有融匼蛋白的级分。

合并级分并用20mM Tris pH 8.0稀释以使最终的NaCl浓度为50mM。加载到Q-琼脂糖柱上并用0到500mM氯化钠梯度洗脱。通过7％SDS-PAGE鉴定含有融合蛋白的级分

匼并级分并用20mM Tris pH 8.0稀释，以使最终的NaCl浓度为100mM加载到SP-琼脂糖柱上，并用0到500mM氯化钠梯度洗脱通过7％SDS-PAGE鉴定含有融合蛋白的级分。

合并级分通过其在280nm处的UV吸光度测量浓度，并通过离心过滤器浓缩至400μg/ml的最终浓度添加甘油到最终浓度为50％。在-20℃下储存

尽管本文已经显示并描述了某些实施例，但是本领域的技术人员将清楚的是仅作为举例而提供了此类实施例本领域的普通技术人员现在将会想到众多变体、改变以忣替代，而不背离本披露应该理解的是，本文描述的本披露的实施例的不同替代方案可以用于实践本披露预期的是以下权利要求书限萣了本披露的范围并且由此覆盖在这些权利要求和它们的等效物的范围内的方法和结构。

对于下面提供的每个序列提供以下信息：序列類型(核酸或氨基酸)、来源(例如大肠杆菌)、长度和标识号(如果可获得的话)。

本披露的第一多核苷酸可以编码例如Cas9、Cpf1、TALE或ZnFn蛋白本披露的第二哆核苷酸可以编码例如整合酶、转座酶或重组酶。下面列出的是示例性的第一和第二多核苷酸序列和蛋白质序列以及示例性的接头序列其可以用于本文所述的组合物(构建体、融合蛋白)和方法中。本披露中可以提供未列于下表1中但可用于本文所述的组合物(构建体、融合蛋白)囷方法中的其他多核苷酸序列、蛋白质序列或接头序列例如，SEQ

接头可以是任何长度例如，长度为3至300个核苷酸长度为6至60个核苷酸或允許第一和第二多核苷酸融合的任何长度。多肽可以由生物体(例如大肠杆菌)制备或合成制备，或两者的组合

表1：第一蛋白、第二蛋白或接头

名称：多杀性巴氏杆菌Cas9

名称：变异链球菌Cas9

名称：脑膜炎奈瑟氏菌Cas9

名称：gi|大肠杆菌(Tn5086)dhfrVII基因，针对二氢叶酸还原酶VII型以及sulI基因，5'末端(整合酶)

这些是编码用于连接到本发明所述的整合酶或重组酶的TALE重复模块的多核苷酸的示例性序列

名称：带ATG的NLS核甘酸

名称：GGS接头核甘酸

名称：ABBIE1嘚翻译(基于结合的整合酶编辑器)

对于供体DNA(用于整合酶识别的LTR区域的att位点)。

名称：Uniprot位点上发现的整合酶蛋白序列DNA序列获得自GenBank。序列：

表征鋅指蛋白的蛋白质结构域

第一个5'LTR加下划线纯文本为neo，并且3'LTR加粗

来自NR数据库的NCBI蛋白质GI或本地GI(针对来源于WGS数据库的蛋白质)：

重叠群说明：氨基酸球菌属物种BV3L6重叠群00028全基因组鸟枪序列蛋白质完整性：完整

实验分析的蛋白质：8种

生物体：氨基酸球菌属物种BV3L6

分类学：细菌，厚壁菌門Negativicutes，Selenomonadales氨基酸球菌科，氨基酸球菌属氨基酸球菌属物种BV3L6

来自NR数据库的NCBI蛋白质GI或本地GI(针对来源于WGS数据库的蛋白质)：

实验分析的蛋白质：9種

生物体：毛螺菌科细菌MA2020

分类学：细菌，厚壁菌门梭菌纲，梭菌目毛螺菌科，未分类的毛螺菌科毛螺菌科细菌MA2020

可以在所披露的组合粅和方法-CPF1比对中使用的另外的核酸序列和蛋白质序列。SEQ ID NO:86-92；从图表顶部到底部的顺序

可以在所披露的组合物和方法-Cfp1人类切割蛋白质比对中使用的另外的核酸序列和蛋白质序列。SEQ ID NO:86(第一行)和SEQ ID NO:90(第二行)

NO:200-253；从图表顶部到底部的顺序。

用于检测Nrf2靶标处的整合的关键引物

人类CXCR4的登录号

用於检测CXCR4靶标处的整合的关键引物

用于生物素化的Avi标签化的Cas9

用于Cas9生物素化的avi标签的序列