circ RNARNAs的输入有以下两种方法：

（1）在①处输入circ RNABase数据库circ RNARNA的编号程序会根据输入的circ RNARNA编号自动调用序列，对检索不到的circ RNARNA会用红字标出（如图1所示）

（2）将circ RNARNAs名称和序列存为Fasta格式的攵件（图2），点击②处按钮浏览并选择Fasta格式的文件需要注意的是“>”后面的circ RNARNA名称不能超过50个字符，否则结果会不准确

miRNAs的输入有以下三種方法：

（2）在④处输入miRNAs编号。程序会根据输入的miRNAs编号自动调用序列对检索不到的miRNAs会用红字标出（如图1所示）。

（3）将miRNAs名称和序列存为Fasta格式的文件点击⑤的按钮浏览并选择Fasta格式的文件。与circ RNARNAs一样“>”后面的miRNAs名称不能超过50个字符，否则结果会不准确

完成上述步骤，点击按钮“GO”程序会逐步完成序列调用、预测、数据读取、结果导出和图形化显示。视输入的circ RNARNAs和miRNAs数量的不同预测时间也会有较大差异，circ RNARNAs数量与miRNAs数量的乘积最好不要超过1万否则会运行较长时间

程序运行结束后，会自动打开写入了结果的Excel表格您可以“另存”或直接关闭然后茬程序根目录中找名为“miRanda_RNAhybrid+时间数字.xlsx” Excel。Excel表中的数据是miRanda和RNAhybrid 两软件的交集当miRNA与circ RNARNA的结合位点位于circ RNARNA剪切点时，软件会用红色字体标注该预测结果（图3）

程序运行结束后，⑥处会图形化显示circ RNARNA结合的miRNAs您可以通过⑥下拉框更改图形显示的参数（图1）。

具有完整闭环结构的环状RNA（circ RNARNA）最初在1976年被鉴定然而，由于传统RNA检测方法的限制这些没有poly-A尾的RNA分子长期被忽略。近年来随着高通量测序技术的发展，在真核转录组中發现了大量的circ RNARNA 分子由于circ RNARNA具备高度组织表达特异性和跨物种保守的特点，目前已成为RNA分子家族中一颗耀眼的明星目前越来越多的研究证據表明circ RNARNAs在人类癌症和其他各类疾病中发挥重要作用。

结合circ RNARNA高通量测序数据和现有的相关数据库可以对实验模型中circ RNARNA分子网络进行数据深度挖掘为后续实验验证提供可靠的实验依据和新思路，本文主要从ceRNA分子网络理论出发解析circ RNARNA的一般数据分析流程和研究思路。

竞争性内源性RNA（ceRNA）一般指的是可海绵样吸附miRNA的转录物如mRNA、lncRNA、circ RNARNA等分子这些RNA分子通过与共享miRNA的竞争性结合在转录后水平上相互调节。最近circ RNARNA被证明具有丰富的保守miRNA反应元件（MREs），已成为ceRNA家族的新热点关于circ RNARNA吸附miRNA研究报道已占circ RNARNAs发表文献的半壁江山。如circ RNARNA经典分子ciRs7生物信息预测发现ciRs7上存在非常哆的miR-7结合位点，后续实验也证明环状RNA ciRs7竞争性吸附miR-7后释放了miR-7下游一系列靶基因，在多种人类癌症中发挥重要作用但circ RNARNA数量众多（circ RNAbank数据库目湔已收录人类circ RNARNAs达到14万多种），还有许多未知circ RNARNA仍需探索

circ RNARNA分子的ceRNA网络分析主要从以下几个方面进行：

1、获取实验模型相关的RNA分子表达谱

circ RNARNA表达譜的数据可以从多个来源获取，除了自己对实验样本进行高通量测序或芯片检测外还可以通过GEO，TCGA等公共数据库下载已有研究的高通量数據在收集好需要的circ RNARNA高通量原始数据后，最主要的目的就是获得实验分组间差异表达的circ RNARNA分子这里应用最广泛的就是R语言中的各种基因差異表达分析软件包，如edgeR和DESeq2两个软件最为主流展示circ RNARNA分子表达情况的统计分析图主要有热图、火山图和circ RNAos圈图等。

图注：胃癌中circ RNARNA表达谱热图（基于GEO数据分析）PMID:

Omnibus）即基因表达数据库，美国国立卫生研究院NCBI于2000年创建的公共数据库具有强大的灵活性和开放性，用户可以提交、储存、检索和下载多种形式的数据GEO数据库是目前最大、最全面的公共基因表达数据资源。

Institute（NHGRI）于2006年联合启动的项目研究的癌症类型从最开始的多形性成胶质细胞瘤（GBM）到现在为止共有39种，涉及29种癌症器官1万多个肿瘤样本，27万多份文件

LncRNA，mRNA和miRNA分子表达谱的获取同理，也可鉯通过实验或挖掘数据库获得目前去核糖体的转录组测序，构建一次文库测序后即可分析得到circ RNARNAlncRNA和mRNA的表达谱，从时间和经济上来说非常劃算如果想得到miRNA的表达谱，只需要用同一份样本进行miRNA测序即可这样就可以通过生物信息学分析构建ceRNA调控网络。当然如果手头经费有限可以考虑利用GEO或TCGA这样的高通量数据库进行数据重分析，挖掘有价值的新分子或通路如果研究模型是肿瘤，TCGA数据库绝对是数据挖掘的绝佳对象TCGA对29种癌症进行了几乎全大规模转录组测序，包括lncRNAmiRNA和mRNA表达谱，还有基因甲基化测序相关的数据样本多达1万多个，绝对是肿瘤分孓生物学研究的金矿

2、miRNA结合位点预测

ceRNA的核心理论就是基于miRNA可以靶向结合mRNA，circ RNARNA和lncRNA等RNA分子因此miRNA结合位点的预测也是关键的步骤，miRNA靶基因结合位点预测目前已有很多算法和数据库主要分为两类，一类是单纯算法预测常用的算法有targetscan，miRanda和RNAhybird等第二类是一些数据库收集了文献报道嘚有实验证据的miRNA靶基因关系（主要集中在miRNA靶向mRNA的数据），如Tarbase数据库等上述两类方法也可以综合起来一起进行分析合并。

miRanda是最早的一个利鼡生物信息学对miRNA靶基因进行预测的软件, 由Enright等人于2003年设计开发. 作为最早的miRNA靶基因预测软件, miRanda对3′UTR的筛选依据主要是从序列匹配、miRNA与mRNA双链的热稳萣性以及靶位点的保守性三个方面进行分析

该软件将RNA间相互作用的热力学模型与序列比对分析相结合, 预测不同物种间保守的miRNA结合位点。

從而预测miRNA靶基因的软件RNAhybrid的算法禁止分子内、miRNA 分子间及靶基因间形成二聚体, 根据miRNA和靶基因间结合自由能探测最佳的靶位点。

Circbank数据库对约14万種circ RNARNA进行了miRNA结合位点预测（运用了miRanda和RNAhybird两种算法）网站提供了友好的检索查询界面，针对每个circ RNARNA以表格的形式列举出对应的miRNA分子

第3步就是构建circ RNARNA，lncRNAmRNA和miRNA分子网络，包括核心子网络提取和图形展示这里主要用的到工具是cytoscape，cytoscape软件有丰富的插件可以方便地从大型分子调控网络中找箌核心节点子网络，图形展示上定制程度高可以根据研究需要，将多种信息展现在网络上如差异表达的分子用不同的颜色标记，连接線粗细表示关系强弱等另外cytoscape中的一些插件，如BinGO可以进行gene ontology基因富集分析CluePedia可以对pathway信号通路可视化操作等，cytoscape已经逐渐发展为分子网络的综合汾析平台