划板挑单克隆_百度文库
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划板挑单克隆
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【求助】挑单克隆
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这个帖子发布于6年零356天前，其中的信息可能已发生改变或有所发展。
最近要做转染，看了好多帖子，但还是很模糊，像大家请教一下。我用6孔板转，网上说转染后要1：10以上传代，然后再加要筛选。这里的1：10传代是要传到6孔板还是传到24孔板也可以。筛选之后，用有限稀释法挑单克隆是要取一部分细胞到96孔板中，那剩下的呢，有人说要随时冻些种子，那是不是细胞数有点少啊，可以把好几个孔中的细胞一起冻吗？
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cari84 就是单克隆过程中，不是先在96孔板挑克隆吗?一定要找只有一个细胞的孔吗？一个细胞好像不太容易长啊。然后转到24孔板再到6孔板再到培养瓶，好多人说要在每一步都留点种子，到底具体怎么做啊，孔里的细胞数好像不够冻种子啊，而且不都是一个孔转到另一个孔啊，怎么冻呢哦，把细胞稀释到&10个/ml，100ul/孔种96孔板。1-2小时后逐孔镜检，多过2个细胞的勾除。7-10天后基本都能长满孔，还有快的。【换液：第3-4天补100ul，隔天吸出100ul,补200ul，待50%铺上细胞9可择机转24孔，转6孔后9可以冻存】【所谓每1步都要留细胞种】我是这样干的，每次换液吸出来的液体，找同等规格的板，加在相同位子的孔里继续培养，作为备份细胞（因为每次跟取液时1起吸出来的细胞都是刚刚分裂下来，还未来得及贴壁的细胞，都特好）。记住只有从1个细胞分离培养出来的株，才具有理论上的唯一遗传特征，才有建立株的意义。
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这里的1：10传代是要传到6孔板还是传到24孔板也可以。A: 1:10传代的意思是一个6孔板传到十个6孔板的意思：）按比例就可以。筛选之后，用有限稀释法挑单克隆是要取一部分细胞到96孔板中，那剩下的呢，有人说要随时冻些种子，那是不是细胞数有点少啊，可以把好几个孔中的细胞一起冻吗？ A:筛选以后，把抗性细胞冻存。只要少部分细胞，以1个/孔和5个/孔的密度，种数块96孔板。记得还是要加抗性的，隔天标记出单克隆的孔。等一到两周左右，就可以了。慢慢把单克隆消化，种到48，24，6孔板里。。。然后鉴定，保存。
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这么多人看怎么没人说话啊，大家给点意见啊
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cari84 这么多人看怎么没人说话啊，大家给点意见啊嗨，都不明白你是要干啥。
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就是要做一个稳定转染呗，大概流程知道一些，具体细节就不太清楚了
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细胞啊还是细菌、酵母啊？
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细胞，肿瘤细胞
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哦具体啥问题，转染我熟悉细菌、酵母，单克隆我熟悉细胞。先下班啦，晚上我来看看啥问题。
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就是单克隆过程中，不是先在96孔板挑克隆吗?一定要找只有一个细胞的孔吗？一个细胞好像不太容易长啊。然后转到24孔板再到6孔板再到培养瓶，好多人说要在每一步都留点种子，到底具体怎么做啊，孔里的细胞数好像不够冻种子啊，而且不都是一个孔转到另一个孔啊，怎么冻呢
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这里的1：10传代是要传到6孔板还是传到24孔板也可以。A: 1:10传代的意思是一个6孔板传到十个6孔板的意思：）按比例就可以。筛选之后，用有限稀释法挑单克隆是要取一部分细胞到96孔板中，那剩下的呢，有人说要随时冻些种子，那是不是细胞数有点少啊，可以把好几个孔中的细胞一起冻吗？ A:筛选以后，把抗性细胞冻存。只要少部分细胞，以1个/孔和5个/孔的密度，种数块96孔板。记得还是要加抗性的，隔天标记出单克隆的孔。等一到两周左右，就可以了。慢慢把单克隆消化，种到48，24，6孔板里。。。然后鉴定，保存。
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cari84 就是单克隆过程中，不是先在96孔板挑克隆吗?一定要找只有一个细胞的孔吗？一个细胞好像不太容易长啊。然后转到24孔板再到6孔板再到培养瓶，好多人说要在每一步都留点种子，到底具体怎么做啊，孔里的细胞数好像不够冻种子啊，而且不都是一个孔转到另一个孔啊，怎么冻呢哦，把细胞稀释到&10个/ml，100ul/孔种96孔板。1-2小时后逐孔镜检，多过2个细胞的勾除。7-10天后基本都能长满孔，还有快的。【换液：第3-4天补100ul，隔天吸出100ul,补200ul，待50%铺上细胞9可择机转24孔，转6孔后9可以冻存】【所谓每1步都要留细胞种】我是这样干的，每次换液吸出来的液体，找同等规格的板，加在相同位子的孔里继续培养，作为备份细胞（因为每次跟取液时1起吸出来的细胞都是刚刚分裂下来，还未来得及贴壁的细胞，都特好）。记住只有从1个细胞分离培养出来的株，才具有理论上的唯一遗传特征，才有建立株的意义。
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谢谢二位前辈了，随时有问题随时向你们请教啊
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cari84 谢谢二位前辈了，随时有问题随时向你们请教啊表客气，继续努力。
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本人也要做
！学习了 。
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学习了，非常感谢！
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学习了，正好在做稳定转染。
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关于丁香园& 【求助】单克隆挑不出怎么办
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【求助】单克隆挑不出怎么办
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【求助】单克隆挑不出怎么办
我用293细胞做转染，转染已经成功了，测过活性还可以，现在在用有限稀释法挑单克隆，但按书上的方法挑了三次都没有成功，就是将细胞稀释到10000个/ml，然后再稀释10倍，再稀释10倍，直到10个/ml，将稀释的细胞液以每孔100微升加到96孔板，但我让它长了20天都没长起来。不知道有什么技巧，请大家给点意见。
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你确定每孔1-2个细胞了吗？分完孔当然要在镜下确认每孔的细胞。
如果有细胞长不起来，有可能是折腾时间太久，细胞状态不好了。
细胞还贴壁吗？如果贴壁接换回液。
单克隆化没什么技巧。
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我是这样做有限稀释的：
单克隆荧光阳性细胞的挑选：荧光蛋白标记的细胞以荧光倒置显微镜和FACS检测荧光细胞百分比，必要时重复转染一次，有限稀释法获得荧光阳性单克隆：于96孔板中8孔为一组，每组除第一孔外其余7孔每孔加入含15%FBS的IMDM50uL（无刻度巴斯德滴管1滴），第1孔中加入100uL细胞密度为1000个/mL的含15%FBS的IMDM，即100个/孔，（以排枪）自第1孔中吸取50ul，以后每孔依次做2：1倍比稀释，丢弃最后1孔中吸出的50uL，常规培养数天~1周后于荧光显微镜下挑选eGFP＋单克隆并扩增。
这个方法可以确保一定有细胞生长，如果比例足够，96孔板中至少有12~24个孔是有1个到2个细胞的，一般会有阳性孔。这种方法起始细胞数可以比较灵活，适合懒人。不象上面提及的经典方法，算得人头晕。我也没有去对过文献，自己想的。
我想，也许这种做法同样可以体现“有限稀释”的本意。
只要阳性率足够，不难。我是用逆转录病毒转的。
不知各位以为如何？
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楼上自创的有限稀释法很好,理论上好象可以,而且是很聪明的方法,我马上就试一下,一周后就知道结果了.
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我做的是整排的有限稀释，
第一排约50cell/100ul/孔
第二排是第一排的一半
直至第十二排，
每次做两板。
这个方法好像2-3个月前在本版说过，
讨论的是真核表达的问题。
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一位在某国做过多年实验的老师，介绍给我如下方法进行单克隆化，他一直使用此法，效果很好，我正在准备试试，现介绍给各位：
将玻璃吸管在酒精灯下烧至熔化,然后两头拉伸并折断一部分使其成为毛细管,在管的另一头套上一个胶管含于口中。此时准备好96孔板，并加上培养液。
在荧光显微镜下观察－选定细胞－将吸管置于细胞上－轻轻吸细胞（在镜下可看到细胞进入了吸管）－将细胞转到96板中。如此操作，选上20～30个细胞培养。然后再选择最亮的含荧光的细胞继续培养。
在此操作中：
（1）最好有一个助手帮忙，主要是在你吸到细胞后，帮助你将96孔板打开；
（2）对于无菌操作，不用太担心，只要每一步都注意一些，不会污染；
如果感兴趣可以试一试，然后在此交流一些操作上的心得，如何！
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用楼上改进的有限稀释法挑了单克隆了,细胞是有了,不过好象没有贴壁,大概是要等两天吧,很有创意的方法,多谢!多谢!
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楼上兄的方法好象和卢圣栋老先生编写的一本书的配套光盘中转基因小鼠的制备异曲同工。有这个光盘或能借到的，可以看看，以供参考。
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已经挑了四五天了,细胞还是没有生长的迹象,即使是在一孔有十几个细胞的孔中,也没有长起来,是时间不够长,还是有其他问题呢?
在挑单克隆的时候我大概总共用了半个小时不到的时间,从用胰酶消化细胞到最后放入孵箱,应该不会太长吧,在筛选稳定细胞株时我用的是800微克/毫升的G418浓度,是否在挑单克隆的时候应该减少呢?
96孔板是greiner bio-one的,用的是10%的胎牛血清,平时用它们做检测,细胞密度用20000个/孔铺板时,细胞的生长都很好的呀,应该不是这方面的问题才对.
本应该是很简单的问题,可就是挑不出来,真的很郁闷,不知道大家是否可以多点意见?
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卢圣栋老先生的配套光盘倒是有两盘，当时是从录像带翻录的。现在好像是12本都有光盘了，不过我还没有见到全套。&海淀图书城“昊海楼404室有卖的。人民卫生出版社出版。
北京的朋友感兴趣可以问问：
Tel：；Fax:转化后挑单克隆提不出质粒，怪！ - 实验交流 - 生物秀
标题: 转化后挑单克隆提不出质粒，怪！
摘要: 转化后挑单克隆提不出质粒，怪！PCR产物和表达载体分别双酶切后胶回收，用T4连接酶连接后转化JM109感受态，过夜培养，长出十来个菌落，挑出培养，结果回收不出来质粒，阳性对照出来了。有没有哪位高人知道这是什么原因吗？ 关键词:[质粒 酶切 表达载体 单克隆 胶回收]……
PCR产物和表达载体分别双酶切后胶回收，用T4连接酶连接后转化JM109感受态，过夜培养，长出十来个菌落，挑出培养，结果回收不出来质粒，阳性对照出来了。有没有哪位高人知道这是什么原因吗？回复:
是质粒摇不出来还是鉴定不对？摇不出来看你抗生素(antibiotic)加没加错，是抗什么的，浓度对不对。PCR产物加保护碱基了么?能确定切对了么？回复:
谢谢你的建议！是质粒摇不出来，质粒回收应该没有问题，因为同时回收出了另一种质粒。我用的抗生素(antibiotic)是氨苄，也曾怀疑是否失活，但如果失活的话，plate应该长很多菌落，但菌落长得不多也不快，最近用其他载体（克隆到T-vector）连接都是很好的，就是与表达载体连接两次都是这样，我怀疑是否连接有问题，就将连接液直接跑电泳检测也跑出了三条带，不过载体和连接产物的带很弱，连接效率很低，不知道加大酶量怎样，我再试试。目的片段胶回收检测大小应该没有问题但是没有测序也不敢肯定。回复:
我前几天就遇到过，就是质粒没提好，可能是质粒的拷贝数低，回复:
建议你 全部重做一次，我以前遇到过只长出5个左右的，也 和 你 一样要不出来，可能是 假的 ，在 做一次是最好的 选择回复:
曾经也碰到这样的情况,也有可能是感受态制作时有污染,造成质粒的拷贝数低,同意楼上观点,长出来的单菌落如果只有几个,往往不是你所要得,要么换换感受态试试?回复:
是呀，我也遇到了这样的问题，连接T载体后只长出几个菌落，提质粒后发现都是杂质粒，可能是感受态被污染了回复:
你挑的菌落长了多长时间,如果超过16小时还是很笑的话,我认为就是假的了,没有继续摇菌的必要了
而且在提质里的时候,加完溶液2,如果还是浑浊的,那么也说明是假的!回复:
谢谢各位！这段时间也没有电脑上网，就不停的做实验了，从双酶切开始重复做了四次，没有一个菌斑长出来，各种对照也做了，感受态没有问题，做连接反应的阳性对照长出了菌斑，不过也很少所有的都涂在一个板子上只长了10个，目前来看可能T4连接酶效率很低，准备换一家公司的试试，就怕不是这个的问题到时候没法向老伴交待，不过也没有办法了，现试试这个再说了。谢谢各位的交流经验，祝我们都顺利吧！
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【求助/交流】悬浮细胞 挑单克隆
有谁做过悬浮细胞挑单克隆的。
1.大家都是用什么方法挑的呀，有的说用有限稀释法，有的说先稀释好一个浓度，然后铺一个孔有一个或者0.5个细胞，但是怎么才能确定一定是单克隆啊，有的时候即使你稀释的很低，也会有几个细胞在一起？
2.96孔板一般铺完几天不动，要不要换液，几天换一次，怎么换液？
3.有没有做过CHO-S的挑单克隆的。
4.细胞不爱活怎么办，谁有好办法吗？
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