COMPOSITE VACCINE FOR PREVENTING AND TREATING ALZHEIMER'S DISEASE AND PREPARATION METHOD THEREFOR
WIPO Patent Application WO/
The present invention belongs to the field of biological products, and discloses a composite vaccine for preventing and treating Alzheimer's disease. The invention is formed by mixing code Aβ42 nucleic acid vaccine and protein gene engineering vaccine. Experiments prove that the present invention uses Aβ42 protein antigen having prokaryotic expression and pVAX-Aβ42 plasmid to achieve co-immunity, thereby enhancing the protein vaccine against Alzheimer's disease in the prior art, producing high-quality IgG antibody against Aβ, causing inhibition of T-cell reaction, and maintaining the effects for a long period. The antibody against Aβ produced by the co-immunity can combine Aβ keratin fibers and natural Aβ protein precipitation in the brain of mice contracted with APP/PS1 Alzheimer's disease transgene, and shows capability of removing Aβ precipitation.
Inventors:
WANG, Bin (No.138, Yixueyuan Rd. Xuhui, Shanghai 2, 200032, CN)
王宾 (中国上海市徐汇区医学院路138号, Shanghai 2, 200032, CN)
YU, Yang (No.138, Yixueyuan Rd. Xuhui, Shanghai 2, 200032, CN)
于杨 (中国上海市徐汇医学院路138号, Shanghai 2, 200032, CN)
Application Number:
Publication Date:
02/07/2013
Filing Date:
07/27/2012
Export Citation:
FUDAN UNIVERSITY (DONG, MeiNo.220, Handan Rd., Yangpu, Shanghai 3, 200433, CN)
复旦大学 (中国上海市杨浦区邯郸路220号董梅, Shanghai 3, 200433, CN)
WANG, Bin (No.138, Yixueyuan Rd. Xuhui, Shanghai 2, 200032, CN)
王宾 (中国上海市徐汇区医学院路138号, Shanghai 2, 200032, CN)
YU, Yang (No.138, Yixueyuan Rd. Xuhui, Shanghai 2, 200032, CN)
International Classes:
A61K39/00; A61K38/16; A61P25/28; C07H21/00
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Domestic Patent References:
Foreign References:
CN1281366A
Other References:
ROSENBERG RN: 'A B 42Gene Vaccine for Prevention and Treatment of Alzheimer's Disease' RINSHO SHINKEIQAKU vol. 50, no. 11, 2010, page 938
Attorney, Agent or Firm:
SHANGHAI EAST ASIA PATENT & TRADEMARK AGANCY CO. LTD (DONG, MeiFloor 4,Building A, No.33, Lane 672, Changle Rd., Jingan, Shanghai 0, 200040, CN)
1、 一种防治老年痴呆症复合疫苗， 包括活性成分和基质， 其特征在于， 所述 的活性成分是以下物质：
( 1 ) Α β 42蛋白基因工程疫苗， （2 ) 编码 Α β 42的核酸疫苗；
所述的 Α β 42蛋白基因工程疫苗的用量为 100 μ 或 200 μ ；所述的编码 Α β 42的核酸疫苗的用量为 100 μ 。
2、 按权利要求 1所述的防治老年痴呆症复合疫苗， 其特征在于， 所述的复合 疫苗中 100 μ 编码 Α β 42的核酸疫苗与 100 μ Αβ42蛋白基因工程疫苗混合。 3、 按权利要求 1所述的防治老年痴呆症复合疫苗， 其特征在于， 所述的复合 疫苗中
100 μδ编码 Α β 42的核酸疫苗与 200 μδ Αβ42蛋白基因工程疫苗混合。 4、权利要求 1的防治老年痴呆症复合疫苗的制备方法，其特征在于，其包括： 1 ) 制备编码 Αβ42的核酸疫苗；
2 ) Α β 42蛋白基因工程疫苗；
3 ) 将所述的 100 μ 编码 Α β 42的核酸疫苗与 100 μ Αβ42蛋白基因工程 疫苗蛋白混合组成复合疫苗；
将所述的 100 μ 编码 Α β 42的核酸疫苗与 200 μ Αβ42蛋白基因工程疫苗 蛋白混合组成复合疫苗。
5、 按权利要求 1所述的防治老年痴呆症复合疫苗， 其特征在于， 所述的复合 疫苗其产生高水平的抗 Αβ抗体 IgG， 同时引起 T细胞反应的抑制。
6、 按权利要求 5所述的防治老年痴呆症复合疫苗， 其特征在于， 所述的 T细 胞免疫抑制反应通过增强 IL10、 TGFp和 fopxp3水平介导。
7、权利要求 1所述的防治老年痴呆症复合疫苗在制备抗 Αβ抗体 IgG， 同时引 起 T细胞免疫抑制的制剂中的用途。
8、 按权利要求 7所述的用途， 其特征在于， 所述的制剂中， Α β 42蛋白基因 工程疫苗的用量为 100 μ 或 200 μ ； 所述的编码 Α β 42的核酸疫苗的用量 为 100 μδ 。
9、 按权利要求 1所述的防治老年痴呆症复合疫苗， 其特征在于， 所述的复合 疫苗的给药方式是 Αβ 42蛋白基因工程疫苗和编码 Αβ 42的核酸疫苗混合后 以混合物形式给药。
Description:
一种防治老年痴呆症复合疫苗及其制备方法
本发明属生物制品领域， 涉及一种防治老年痴呆症复合疫苗及其制备方法。 背景技术
痴呆症属于脑部疾病， 是由于脑部不正常的退化引起的疾病。 有统计显示， 患 者多为老年人， 临床表现为： 患者由于大脑功能衰退， 无论在记忆、 运算、 学习、 理解、 甚至语言、 判断力、 方向感等方面都受到影响。 该疾患不仅患者自身痛苦， 对于其家庭乃至整个社会都会造成极为消极的影响。 随着老龄人的增多， 老年性痴 呆症患者也在不断增加。 阿尔茨海默病 （Alzheimer' s di sease , AD ) 即老年痴呆症 是退行性痴呆症的一种常见形式。 目前全世界大约有 2500万以上的 AD患者。 由于 其发病年龄段的特点， 备受处于老龄化阶段国家的重视， 因此， 对于 AD的研究意义 重大。 大量研究证实， 中枢神经系统的退行性疾病通常是由于某种蛋白的异常所导 致， 目前已认识到， 与退行性痴呆症密切相关的有三种最重要的蛋白， 分别是淀粉 质前体蛋白 ( amyloid precursor protein, APP ) 、 Tau蛋白禾口 a— synuclei (核突 触蛋白 -α) 。 所述关键蛋白的明确为退行性脑部疾病种类的划分提供了依据； 上述 阿尔茨海默病（AD )被归为与淀粉质前体蛋白 （ΑΡΡ )代谢紊乱相关的一类退行性痴 呆症。
迄今为止， AD发病的确切机理尚未完全清楚， ΑΡΡ异常致病论也不是唯一的理 论， 但有一点可达到共识， 就是由 ΑΡΡ产生的淀粉样蛋白 - ( amyloid β-peptide , Αβ ) 在 AD的病理学上起了重要作用， δΡ β淀粉样蛋白神经元毒性引起神经元退行的学说 仍占主导地位； 该学说的机理总结为： AD患者主要的病理改变有二， 一是病变部位 神经元胞浆内出现神经纤维缠结 （neuro-fibri l lary tangles , NFT ) ， 二是产生老 年斑 （seni le plaques , SP ) 。 研究显示， 神经纤维缠结的主要成分是以成对双螺 旋丝样结构形成聚集的异常磷酸化的 Tau蛋白； Tau蛋白是一种与微管蛋白有关的磷 蛋白， 位于神经元的突触上， 在成人脑中， 正常情况下， Tau蛋白通过与微管蛋白结 合而剌激微管蛋白集聚， 并帮助维持和稳定细胞内骨架； 当 Tau蛋白过度磷酸化、异 常糖基化、异常糖化、泛素蛋白化或所含微管结合基序的数目减少都会影响 Tau蛋白 与微管的结合， 使神经纤维退化。有研究显示， AD患者脑内可见 Tau蛋白的过度磷酸 化或异常磷酸化， 且患者脑组织中的微管集聚功能明显受损。 另一方面， 老年斑的 成分是 Αβ， Αβ由 APP产生， 中枢神经系统神经元、 星形细胞、 小胶质细胞、 少突胶 质细胞、 内皮细胞均能表达 APP ; 正常情况下， Αβ仅有极少量的表达； 低浓度的 Αβ 对未分化、 不成熟的神经元有营养作用， 而高浓度的 Αβ对已分化的成熟的神经元则 有毒性作用。 已知 Αβ的沉淀与 ΑΡΡ的过度表达和异常加工有关； ΑΡΡ经 β， γ分泌酶降 解产生 Αβ生成可溶性和不可溶性两种状态， 不溶的以 β折叠为主， 上述构象有利于 Αβ的聚集。 Αβ在形成高密度、 纤维状的聚合体后可引起神经毒性， 包括直接的毒性 和增强、 放大各种伤害性毒性， 从而妨碍神经细胞的正常生长与传导， 最终导致神 经细胞的死亡， 引发 AD。 另有关转基因小鼠的研究显示， APP和 Tau蛋白的突变都会 导致 Tau沉淀神经纤维缠结，但其产生的淀粉样斑块在结构和数量上却完全不同，所 述结果也进一步说明在 AD的发展进程中 APP的改变先于 Tau的改变。 当前， 有越来越 多的证据表明， Αβ分解代谢和清除中遗传性改变罹患晚发型 AD的危险大大增加， 该 证据都为 Αβ致病说提供了依据。
所述的阿尔茨海默病的发生最终归根于神经组织受损， 而导致这一事件发生的 原因可能不是单一的方面， β淀粉样蛋白的神经毒作用表现为多种因素导致 AD发病 的共同通路， 错误折叠的 Αβ导致 AD的病理和临床表现； AD的病因有多种推测， 比如 环境、 遗传、 体内某些化学因素等。 目前， 通过对 AD患者病变部位的免疫学和生物 化学方面的研究发现， 病变部位小胶质细胞及星形细胞高度活化， 补体亦有产生， 另外还有一些炎症细胞因子、 急性期反应物质、 蛋白酶及蛋白酶抑制剂增高。 上述 研究结果充分说明炎症反应与 AD的病变有着密切关系， 因此有观点认为 AD的神经元 损害大多为机体对病原体、 β淀粉样蛋白、 神经纤维缠结的炎性反应所致； 炎性反 应中， 吞噬作用不仅吞噬病原体、 β淀粉样蛋白、 神经纤维缠结等， 造成旁观神经 元的损伤而产生更多的病灶， 同时， 活化的小胶质细胞及补体激活产生的炎症细胞 因子等使炎症反应维持并不断的增强， 形成一个恶性循环。 AD的许多促发因素如遗 传、 环境因素等诱发的初始病变一旦形成即可激发炎症反应， 恶化后则导致更多的 神经元死亡， 产生更多病灶， 继而激发更多的炎症反应， 则 AD病情急剧加重。 还有 研究证实， AD的神经病理组织中存在 IL1、 IL2、 IL6、 TNF、 TGF等细胞因子的高表达； 所述的细胞因子可直接导致神经元细胞的死亡和凋亡，还可通过促使细胞黏附分子、 补体分子、 载脂蛋 Θ Ε、 ΑΡΡ、 Αβ的表达产生急性炎症反应， 促进可溶性 Αβ形成难溶 性纤维等加剧 AD的病理过程。 此外， 小胶质细胞、 星形细胞和单细胞是脑内主要的 免疫细胞， 这些免疫细胞具有双重作用： 当与淀粉样老年斑接触后即发生活化、 合 成、 分泌细胞因子、 炎性蛋白或蛋白酶抑制剂， 促进 Αβ肽的积累， 导致神经元损伤 和免疫功能下调； 但弥散性的神经胶质细胞或单细胞却可通过溶酶体途径降解 Αβ 肽。 目前已有研究证实， Αβ纤维可作为一种免疫信号， 促进小胶质细胞的吞噬作用 去除 Αβ纤维。 上述 Αβ特异性的免疫反应可能代表了一种自然防御机制， 以抵抗淀粉 样物质的沉积， 但这些免疫机制在重症 AD患者中都呈降低趋势。
目前， 临床对于老年痴呆症的治疗， 首先考虑的是对症治疗， 如， 应用修复受 损神经元的药物改善临床症状： 神经节苷脂能有效修复受损或濒死的脑神经细胞， 促进神经的修复再生及神经网络的重塑； 胆碱酯酶抑制剂、 脑代谢激活剂、 抗抑郁 药物等有助于活血通络， 改善脑循环。 现已知脑内乙酰胆碱含量与记忆密切相关， 老年人或痴呆病人脑内乙酰胆碱量减少，补充胆碱类药物能改善其记忆和思维能力； 但是， 对症治疗可以说只是缓解， 治标不治本， 因而基于 AD致病机理的治疗方法因 其本领域研究者的关注， 主要是针对 Αβ形成的沉淀， 比如， 由于 β、 γ分泌酶是 ΑΡΡ 形成 Αβ肽的两个关键的酶， 因此抑制任何一个酶都可以阻断 Αβ肽的产生， 故 、 γ分 泌酶的抑制剂药物的筛选成为一种重要的手段； 再者，就是老年痴呆症疫苗的研发； 1999年 Schenk首次应用 PDAPP转基因小鼠， 证实接种化学合成的 Αβ42， 可以减少脑 内 Αβ， 脑内无老年斑沉积、 神经元失营养和星形胶质细胞炎症， 同样还具有治疗效 果， AD主动免疫治疗方法的探究由此开始了新纪元； 继而， 又有诸多科学家通过 Αβ 免疫的方法减轻了动物 AD的病理特征， 由此可见， 在 AD动物病理模型中， 通过主动 免疫确实可以预防和减轻脑内 Αβ沉积。 2001年， 新疫苗 ΑΝ-1792 (合成的人 Αβ42肽） 在 100余例轻度到中度 AD患者中进行了 I期临床试验， 不同剂量给药后， 人体均能较 好地耐受，相当数量的患者还产生了较强的体液免疫反应； 上述结果使 AN-1792顺利 进入 I I期临床试验。 然而， 2002年 3月， 在参加 I I期临床试验的 360个病人中， 有 15 人先后出现了中枢神经系统非细菌性炎症， 2例出现了局部缺血性中风，该项临床试 验因而被迫终止。
有研究进一步证明，所述非菌性脑炎可能为 Τ细胞引起的免疫并发症； 因为尸检 证实脑膜内 Τ细胞侵润大多是 CD4 + T细胞，少量 CD8 + T细胞，研究者认为是患者产生 了自身免疫反应而引起的脑炎的发生； 上述结果使 AD疫苗一方面有着喜人的疗效， 另一方面又出现了致命的副作用； 因此， 若能降低或消除免疫带来的副作用即可达 到最初利用免疫产生的 Αβ抗体清楚淀粉样蛋白的目的。 为此， 研究者们在不断的研 究与探讨之中提出了不同的解决方案， 比如，在疫苗治疗同时加用非甾体类抗炎药、 抗病毒药或激素以预防炎症的发生， 另外， 还有应用 Αβ亚单位疫苗， 去除 Αβ毒性片 段， 可在产生抗体的同时抑制了不良的细胞反应； 但上述方法都有其不利的一面， 比如激素等抑制剂亦有副作用， 采用亚单位疫苗， 产生的抗体滴度不是很高等等。 因此更好的方法有待探索。
本发明的目的是提供新的防治老年痴呆症的疫苗， 具体涉及一种防治老年痴呆 症疫苗及其制备方法。 尤其涉及一种包括 Αβ 42蛋白基因工程疫苗和编码 Αβ 42的核 酸疫苗的复合疫苗。 本发明的复合疫苗； 能克服现有技术的 AD蛋白疫苗的缺陷， 预 防、 治疗老年痴呆症更加安全有效。
本发明中， 包括所述的复合疫苗在用于老年痴呆症预防、 治疗时， 联合使用 Αβ42蛋白基因工程疫苗与编码 Α β 42的核酸疫苗， 以产生高水平的抗 Αβ抗体 IgG， 同时通过增强 IL10、 TGFp和 fopxp3水平介导引起 T细胞反应的抑制。 本发明实验证实， Αβ 42蛋白基因工程疫苗和编码 Αβ 42的核酸疫苗组成的复 合疫苗， 或在给予 Αβ 42蛋白基因工程疫苗时， 联合使用编码 Αβ 42的核酸疫苗可 显著提高老年痴呆症的治疗效果。 增加安全性。
本发明所述的复合疫苗， 包括活性成分和基质， 所述的活性成分是以下物质： (1) Αβ42蛋白基因工程疫苗 （以下简称： 蛋白） ；
(2) 编码 Α β 42的核酸疫苗 （以下简称： DNA) 。
上述活性成分的剂量如下述：
(1) Αβ 42蛋白基因工程疫苗的剂量为 100 μ 或 200 μ ；
(2) 编码 Αβ 42的核酸疫苗的剂量为 100 μ ；
使用时，所述的 100 μδ Α β 42DNA与 100 μδ Αβ42蛋白混合，或 100 μδ Α β 42DNA 与 200 μ Αβ42蛋白混合， 本发明中， 优选以 100 μ Α β 42蛋白与 200 μ Α β 42 DNA 混合。
本发明中， 所述的蛋白疫苗是将某种病毒的目的抗原基因构建在表达载体上， 将已构建的表达蛋白载体转化到细菌、 酵母或哺乳动物或昆虫细胞中， 在一定的 诱导条件下， 表达出大量的抗原蛋白， 通过纯化后制备的疫苗；
本发明中， 所述的 DNA疫苗又称核酸疫苗、基因疫苗（engineering vaccine )， 是将病原的保护性抗原编码的基因片段克隆入表达载体，用以转染细胞或真核细 胞微生物及原核细胞微生物后得到的产物， 或者将病原的毒力相关基因删除掉， 使成为不带毒力相关基因的基因缺失苗。
本发明中， 制备所述的疫苗时， 所需试剂成分不要求特殊的反应条件， 一般生 物制品药厂的设备即可生产。
本发明的预防、 治疗老年痴呆症的疫苗能引起 T细胞免疫抑制， 而不影响抗体 的正常产生， 且具有抗原专一性； 所述的特异性细胞（T细胞）免疫抑制反应是通过 增强 IL10、 TGFp和 fopxp3水平介导， 从而对免疫反应进行有效调节， 能防止机体中 不必要的炎症损伤。
本发明进行了大量的实验， 包括：
( 1 ) Αβ42蛋白疫苗与 DNA疫苗联合免疫不同小鼠鼠种后产生抗体情况的 ELISA 检测和 Τ细胞反应检测， 结果显示， Balb/c小鼠二免后 14天血清和 28天血清的 IgG稀 释了 400后的 0D值的比较中， Co42共免疫组较高， C57小鼠结果与前者相似； 两个鼠 种免疫后的 T细胞增殖实验显示 Co42组 SI剌激指数显著降低， 与单独免疫蛋白或 DNA 组差异很显著；
( 2 ) Αβ42蛋白疫苗与 DNA疫苗共免疫在老年 C57小鼠上的效果检测， 结果显 示， 共免疫 Co42组和单独免疫蛋白组都能达到相当高的水平 （至少 51200倍） ， T 细胞反应受到抑制， 与单独免疫组相比较有显著性差异；
( 3 ) Αβ42蛋白疫苗与 DNA疫苗共免疫剂量检测， 结果显示， 当 DNA免疫的剂 量为 100μ ， 随着加入的蛋白量的增加， 抗 Αβ42抗体浓度也相应增高， 但 Τ细胞增 殖却不显示为线性上升的趋势， 而是在 lOO gDNA 与 100 μ Αβ42 蛋白， 以及 100 gDNA与 200 μ Αβ42蛋白混合时出现免疫抑制， 其中， 以 100 μ 与 200 μ 混 合时， 免疫抑制结果差异显著；
( 4) Αβ42抗原联合免疫长效性实验， 结果显示， 共免疫组最后一次免疫后到 第 56天抗体低度有所下降， 但仍处于一个较高的水平： 128000; DNA免疫组抗体滴 度一直很低， 这与 DNA免疫诱导主要 TH1反应的机理相关， 且与免疫剂量和未加免 疫佐剂有关系； Τ 细胞增殖结果显示， 联合免疫的免疫抑制持续存在， 在共免疫后 相当长一段时间内 T细胞一直未被激活；
( 5 ) 抗血清与 Αβ纤维的结合能力检测， 结果显示， 相同稀释度下， 200μβ蛋 白与 lOO gDNA共免疫组结合的 Αβ纤维 （F. L. I.提供） 最多， 其结合能力最强， 其 次是 100μ 蛋白与 lOO gDNA共免疫组， 再次是单独 100μ 蛋白， 最少的是单独 lOO gDNA组； Dot Blot结果与抗体 IgG滴度的结果相一致， 结果表明， Αβ42抗原 免疫产生的抗体可有效地结合 Αβ蛋白纤维；
同时， 实验结果还表明， 血清中的针对 Αβ42的抗体能与脑组织中的 Αβ蛋白结 合， 功能显著； 而单独免疫 DNA组， 由于抗体低度很低， 几乎无 Αβ斑块染出； ( 6 ) 细胞因子水平测定， 结果显示， CD4-IFNY在免疫组中变化不明显， Αβ42 蛋白免疫组的 CD4-IL4表达量较高， IL4与炎症反应关系密切， 而当 Αβ42蛋白与 DNA共免疫后， IL4的表达量降低， 结果表明， 共免疫抑制 IL4的表达， 与抑制炎症 反应相关； 此外， CD4-IL10和 foxp3在蛋白与 DNA共免疫组内都高表达， 免疫抑制 的发生与诱导出了高表达 foxp3和 IL10的 T调节性 T细胞有关， 且 RT-PCR的结果 依然显示了 T细胞高表达 IL10和 TGFp;
( 7 ) 免疫小鼠脑组织中 CD4+T细胞免疫组化染色情况实验， 结果显示， 在组 织切片中没有发现大量的 CD4细胞浸润， 但在单独免疫蛋白组的脑切片中血管内， 或血管附近都发现了少量阳性细胞， 单独免疫 DNA组切片也显示了一些阳性细胞， 与 DNA疫苗产生比较强的 Thl型 T细胞反应有关； 在 Naive阴性对照组， 脑血管内 及其周围都未见异常， Αβ蛋白与 DNA共免疫组则同样未见阳性 T细胞出现； 结果表 明， Αβ蛋白与 DNA联合免疫能有效防止副反应脑膜炎的发生。
实验结果表明，本发明利用原核表达的 Αβ42蛋白抗原与 ΡνΑΧ-Αβ42质粒共免疫， 改进了老年痴呆症蛋白疫苗， 能产生高水平的抗 Αβ抗体 IgG， 同时引起了 T细胞反应 的抑制， 且可持续相当长一段时间； 所述共免疫产生的针对 Αβ的抗体具有结合 Αβ蛋 白纤维以及 APP/PS1老年痴呆症转基因发病小鼠脑内天然 Αβ蛋白沉淀的功能， 显示 其清除 Αβ沉淀的能力； 本发明为预防、 治疗老年痴呆症提供了一种极具潜力的、 有 效的、 无副作用的疫苗。
本发明的疫苗与现有技术相比还具有以下优点：
( 1 )所述的 Αβ42蛋白疫苗与 Αβ42?ΝΑ疫苗联合免疫的疫苗与单独蛋白疫相比， 如用于 I I临床实验的 AN-1792疫苗相比更为安全有效，能抑制脑膜炎副反应的发生； 与抗 Αβ单抗相比造价更加低廉， 更加持久；
( 2 ) 能引起 Τ细胞免疫抑制， 而不影响抗体的正常产生， 且具有抗原专一性； 所述的特异性细胞 （Τ细胞） 免疫抑制反应是通过增强 IL10、 TGFp和 fopxp3水平 介导， 从而对免疫反应进行有效调节， 以防止机体中不必要的炎症损伤， 能有效地 克服现有的老年痴呆症疫苗免疫治疗中的缺点；
( 3 )制备本发明所述的疫苗时， 所需试剂成分不要求特殊的反应条件， 一般生 物制品药厂的设备即可生产， 生产方法简单， 易于工业化生产；
( 4) 本发明的疫苗可用于老年痴呆症的治疗或者初期预防。
为了便于理解， 下面通过附图和具体实施例对本发明的预防、 治疗老年痴呆症 的疫苗进行详细的描述。 需要特别指出的是， 具体实施例和附图仅是为了说明， 显 然本领域的技术人员可以根据本文说明， 对本发明进行各种修正或改变， 这些修正 和改变也将纳入本专利范围之内。
图 1为本发明的 ρΜ018-Τ-Αβ42、ΡνΑΧ1-Αβ42和 pVAX l Αβ40质粒酶切电泳图， 其中，
Α为 BamHI禾口 xbal双酶切 1、 2: ρΜ?18-Τ-Αβ42 Ml : DL2000 marker M2: DL15000 marker,
B为 BamHI禾口 xbal双酶切 3、 4： pVAXl-A 42 M: DL15000 marker。
C Vector pVAXl 空载 BamHI 禾口 xbal 双酶切， Αβ40 pVAXl- Αβ40 BamHI 和 xbal双酶切， M: DL2000 marker。
图 2鉴定 ρνΑΧ1-Αβ42和 ρνΑΧ1_Αβ40表达， 其中，
A显示了本发明的 RT-PCR鉴定 ΡνΑΧ1-Αβ42表达；
Β显示了 Western-blot鉴定 ρνΑΧ1_Αβ40真核表达。
图 3为本发明的 pMD18-T-Ap42和 PET28a_Ap42质粒酶切电泳图， 其中， A为 BamHI禾口 Sai l双酶切 1、 2： ρΜ?18-Τ-Αβ42 M: DL2000 marker,
B为 BamHI禾口 Sai l双酶切 3、 4： pET28a-A 42 M: DL2000 marker。
图 4为本发明的 pMD18-T-Ap422c酶切电泳图和 pET28a_Ap422c菌落 PCR电泳 图， 其中，
A为 BamHI禾口 EcoRI双酶切 1、 2： pMD18_T_Ap2c M: DL2000marker, B为 2-7 : 菌落 PCR结果 M: DL2000marker。
图 5 显示了本发明的一拷贝 Αβ42 蛋白与两拷贝蛋白原核表达 SDS-page 和 Western Blot。
图 6为本发明的 Balb/c和 C57小鼠免疫后抗 Αβ42抗体 IgG比较图。
图 7为本发明的 Balb/c和 C57小鼠免疫后 T细胞增殖实验结果比较图。
图 8显示了本发明的老年小鼠免疫后抗体和 T细胞增殖实验结果。
图 9显示了本发明的 Αβ42抗原共免疫剂量实验结果，其中， Α为抗体滴度检测 结果； B为加强免疫后 7天， MTT法 T细胞增殖结果； C为 C57小鼠免疫后抗 Αβ42 抗体 IgG检测结果； D为 C57小鼠免疫后 T细胞增殖实验结果。
图 10显示了本发明的 Αβ42抗原共免疫长效性实验结果， 其中，
Α :在三次免疫后第 28天， 42天， 和 56天采集血清检测抗 Αβ42抗体 IgG， 共 免疫组第 42天滴度达到最高 640000倍， 第 56天有所下降， 滴度达达 128000倍， B: 第 57天处死小鼠， 检测 T细胞增殖情况。
图 11显示了本发明的 Αβ42免疫抗血清与 Αβ蛋白纤维体结合能力的 Dot Blot 检测结果。
图 12显示了本发明的抗血清与 APP/PS1老年痴呆症转基因发病小鼠脑内 A 沉 淀结合荧光染色结果。
图 13显示了本发明的 Αβ42蛋白与 DNA共免疫细胞因子表达结果。
图 14显示了本发明的 Αβ42蛋白与 DNA共免疫 APP老年痴呆症模型小鼠结果。 图 15显示了本发明的共免疫 APP老年痴呆症模型小鼠结果， 其中，
A为水迷宫实验示意图， B为水迷宫实验第 2天小鼠游动轨迹图， C为水迷宫实验 第 1-5天寻找平台时间统计图， D为水迷宫实验第 2天寻找平台时间统计柱状图， E为 水迷宫实验第 6天小鼠游动轨迹图， F为水迷宫实验第 6天小鼠第 4. 5象限出现时间统 计柱状图， G为抗体滴度检测结果， H为 MTT法 T细胞增殖结果。
具体实施方式
下述实施例中所提到的实验方法如无特别说明， 均为常规方法； 所提到百分含 量如无特别说明均为质量百分含量。
从大肠杆菌中提取质粒 DNA， 在苯酚氯仿溶液中去掉蛋白质， 双链 DNA经乙醇 沉淀而分离出来。
以上提取方法和技术的详细描叙可在 Sambrook等人的 "Molecular Cloning" (第 二版 1998， Cold Spring Harbor Laboratory Press, 纽约） 和厉朝龙等编， 《生 物化学与分子生物学实验技术》 浙江大学出版社查寻。
制备蛋白质和多肽：
从基因工程表达菌或细胞中提取。 这些方法是公知的， 在 Doonan 的" Protein Purification Protocols" ( 1996， Humana Press, NJ) 中有详细描叙。
制备老年痴呆症 Αβ42核酸疫苗：
1 ) 老年痴呆症 Αβ42真核表达质粒的构建：
以质粒 Abeta 42-C3d3 (麦克阿哥贾聂博士提供） 为模板， 在引物 P1 : 5 ' - AAAGGATCCATGGATGCAGAATTCC - 3 '禾卩引物 P2: 5 ' - GCCTCTAGATTACGCTATGACAACA - 3 '， (在引物 1和引物 2， 分别引入 BamHI识别位点和 Xbal识别位点） 的引导下 PCR 扩增 Αβ42基因。反应体系： Ι μ ?质粒模板， 引物 1和引物 2各 lOpmol , 500mM KCl , lOOmM Tris-HCl ( pH8. 4) ， 1. 5mM MgCl2, 100 μ g/mL BSA， ImM dNTPs, 2. 5U Taq DNA 聚合酶，总体积为 25 μ L; 反应条件为： 94°C 变性 30秒， 60 °C 复性 30秒， 72°C 延 伸 30秒， 共 30个循环； 再将在 1. 5%脂糖凝胶电泳中的 DNA扩增片段回收， 连接于 PMD18-T克隆载体上； 将连接产物转化入 DH5a细菌感受态细胞， Amp1抗生素 LB固 体培养基筛选阳性菌落， 提取质粒， 经 BamHI和 Xbal双酶切鉴定， 结果如图 1A所 示， 箭头所指为连接入载体的目的片段， 大小为 132 再将目的基因以 BamHI和 Xbal双酶切，回收脂糖凝胶电泳中的 DNA Αβ42基因片段，连接于 pVAXK invitrogen) 真核表达载体上。将连接产物转化入 DH5a细菌感受态细胞， Kana1抗生素 LB固体培 养基筛选阳性菌落， 提取质粒， 以 Hindl l l和 EcoRI酶切鉴定结果如图 1B所示， 箭 头所指即为目的片段， 且经序列分析后 Αβ42基因序列完全正确。
2 ) 老年痴呆症 Αβ42质粒在真核细胞中的表达：
利用脂质体法将 ΡνΑΧ1-Αβ42转染 ΒΗΚ细胞系， 48小时候收获细胞，提取总 RNA ( TRIZ0L,鼎国生物公司），反转录为 cDNA，反转录依照大连宝生物公司 RNA RT-PCR 操作指南， 取纯化的 1μ 总 RNA置 250μ? 离心管中， 然后依次加入相关试剂： 4μ1 MgCl2， 2μ1 10 X缓冲液， 8. 5μ1 DEPC水， 2μ1 dNTP 混合物， 0. 5μ1 RNase inhibitor, 0. 5 μ 1 M-MLV 反转录酶 （Promage公司） ， 0. 5 Ol igo ( dT ) 12引物； 反应条件 为 42 V 30min， 99 °C 5min， 5 °C 5min。 再以第一链 cDNA产物为模板，以上述引物 进行 PCR反应， 检测 Αβ42的表达带； 结果如图 2所示， 转染了 ΡνΑΧ1-Αβ42质粒组 的细胞通过 RT-PCR 的方法扩增出了目的条带， 阴性对照 （-) 为不加反转录酶的 RT-PCR反应组， 阳性对照 （+ ) 为 ΡνΑΧ1-Αβ42质粒作模板的 PCR对照。
Αβ42蛋白的原核表达：
1 ) 老年痴呆症 Αβ42原核表达质粒的构建：
以 Abeta 42 - C3d3为模板， 在弓 I物 1： 5 '- AAAGGATCCATGGATGCAGAATTCC - 3'禾口 弓 I物 2： 5'- GCCGTCGACTAACGCTATGACAACA _3 ' (在弓 |物 1禾口弓 |物 2， 分另 ij弓 |人 BamHI 识别位点和 5 3/4 71识别位点） 的引导下 PCR扩增出 Αβ42基因； 回收目的片段连接于 PMD18-T载体， 经酶切鉴定正确后将目的片段亚克隆到 pET28a载体上， PCR体系与 回收、 酶切鉴定方法与 "实施 1 "相同。 结果如图 3所示， A为 ρΜ?18Τ-Αβ42质粒 经 BamHI和 Sai l双酶切结果， B为 ρΕΤ28&_Αβ42质粒经 BamHI和 Sai l双酶切结果， 且序列分析结果正确。
以 ρΜ?18Τ-Αβ42为模板， 在弓 I物 1 : 5'_ AAAGGATCCATGGATGCAGAATTCC _3'禾口弓 | 物 2 : 5'- GCCGTCGACTAACGCTATGACAACA —3' (在弓 |物 1禾口弓 |物 2， 分另 ij弓 |人 BamHI 识 别 位 点 和 SaR 识 别 位 点 ） 和 overlap DNA 片 段 1 ： 5 ' - TCGGAATTCTGCATCTCCTCCTCCCGCTATGACAA -3 ' 和 片 段 2 ： 5 ' - CGGTGTTGTC ATAGCGGGAGGAGGA -3 ' 引导下， 进行 overlap PCR反应， 扩增出两拷贝的 Αβ42基 因， 反应体系： Ιμ?质粒模板， 引物 1、 引物 2和 overlap DNA片段 1、 片段 2各 lOpmol , 500mM KCl， lOOmM Tri s-HCl ( pH8. 4 ) ， 1. 5mM MgCl2 , lOO g/mL BSA， ImM dNTPs , 2. 5U Taq DNA聚合酶， 总体积为 25μ?; 反应条件为： 94°C 变性 30秒， 58 V 复性 35秒， 72 °C 延伸 30秒， 共 30个循环； 回收两拷贝的 Αβ42基因片段连接 于 PMD18-T载体， 经酶切鉴定正确后将目的片段亚克隆到 pET28a载体上， 经菌落 PCR鉴定出阳性株。 酶切鉴定方法与 "实施例 1 "相同。
2 ) 一拷贝 Αβ42蛋白与两拷贝蛋白原核表达：
将 pET28a-Ap42和 pET28a-Ap422c质粒转化入 BL21 ( DE3 ) 原核表达菌株感受 态细胞， 筛选阳性菌株后以不同浓度 IPTG诱导蛋白表达， 诱导体系为 5ml菌液， 温 度为 37°C或 25°C， 诱导时间为 4小时； 收集菌体， 重悬于预冷的 PBS中 （包含终 浓度： 10 mL/L Triton X-100、 lmg/ml溶菌酶）， 用超声裂解细菌， 再以 12000 rpm， 于 4°C离心 15 min， 分离上清和沉淀分别用于 SDS-page电泳检测； 经检测表达出的 蛋白在沉淀中为包涵体， 结果如图 5A所示， 沉淀 SDS-page中一拷贝的 Αβ42蛋白 大小约 7KD (箭头所指） ， 在 1. OmMIPTG时诱导， 表达量最大， 图 5B中左图所示两 拷贝 Αβ42重组质粒的 BL21菌阳性菌株在不同 IPTG浓度下蛋白诱导的表达情况， 右图显示表达为包涵体沉淀形式， 且最佳诱导温度是 37°C ; 两个拷贝 Αβ42蛋白大 小约 13KD (下箭头所指） ， 同时在 2倍大小 （约 26KD) 的位置还发现有很浓的表达 条带 （上方箭头所指） ， 鉴于 Αβ42蛋白倾向于聚集的性质， 故怀疑形成了二聚体。 利用 Westerb Blot进行检测，鉴定诱导表达出的蛋白确为 Αβ蛋白。将经镍柱（QIAGEN 公司） 纯化后的 Αβ42蛋白进行 SDS-page, 经过转膜将蛋白转至硝酸纤维素膜上， 1%BSA封闭一个小时，一抗 6E10(mouse )抗 Αβ单克隆抗体（Leibniz Institute-Fritz Lipmann Institute, F. L. I.提供） 1： 1000室温孵育 1小时， anti-mouse-HRP二抗 ( invitrogen) 1： 2000室温孵育 1小时，显色；结果如图 5C所示，左图为 SDS-page 考马斯亮蓝染色结果，右图为 Western Blot结果，箭头所指分别为两个拷贝的 Αβ42 蛋白和两个拷贝 Αβ42蛋白的二聚体 （上箭头所指） 。
Αβ42蛋白疫苗与 DNA疫苗联合免疫不同小鼠鼠种后产生抗体情况的 ELISA检测和 Τ 细胞反应检测：
选择 6-8周龄的 Balb/c和 C57BL/6两个鼠种的小鼠进行免疫，通过检测抗体 IgG 和 T细胞增殖反应， 检测 Αβ42蛋白疫苗与 DNA疫苗联合免疫是否能引起免疫抑制， 且同时不影响抗体的产生。
1 ) Αβ42蛋白疫苗与 DNA疫苗联合免疫 Balb/c和 C57BL/6小鼠后产生抗体情况的 ELISA检测：
将 16只 6-8周龄 BALB/c或 C57BL/6雌性小鼠分为 4组， 每组 4只； 第一组肌 肉注射含 50微克 pVAXl- Αβ42质粒 DNA的 PBS溶液 50微升； 第二组皮下免疫含一 拷贝 Αβ42蛋白 50微克， 1/2体积弗氏完全佐剂乳化完全的蛋白抗原 50微升； 第三 组同时皮下免疫含一拷贝 Αβ42蛋白 50微克， 1/2体积弗氏完全佐剂乳化完全的蛋 白抗原 50微升以及肌肉注射含 50微克 pVAXl- Αβ42质粒 DNA的 PBS溶液 50微升； 第四组为不处理的 Na'ive组；第 14天再以相同注射方式和剂量加强免疫一次，取第 二次免疫后 14天、 28天的血清用 ELISA法测定其抗体滴度， 检测方法为： 将 96孔 酶标板用 10ug/ml Αβ42蛋白抗原包被， 4°C过夜， 3%小牛血清 37°C封闭 1 PBST ( 0. 05% Tween20 溶于 PBS) 洗涤 3次， 每次 5分钟； 加入不同稀释度的免疫小鼠 血清， 以未免疫的小鼠血清作对照， 37°C孵育 1小时； PBST洗板三次后， 每孔辣根 过氧化物酶标记的羊抗小鼠 IgG (二抗， Sigma, St. Louis) ΙΟΟμΙ , 37°C孵育 1小 时后弃去， PBST洗涤 3次， 每次 5分钟； PBST洗三次， 加入底物 TMB液 ΙΟΟμΙ， 室 温显色反应 20分钟， 2Μ硫酸中止反应， 用酶标仪测定 0D45。/62。光密度值。 Balb/c小 鼠结果如图 6a所示， 二免后 14天血清和 28天血清的 IgG稀释了 400后的 0D值的 比较， 显示 Co42共免疫组较高， C57小鼠如图 6B所示， 结果与前者相似。
2 ) Αβ42蛋白疫苗与 DNA疫苗联合免疫 Balb/c和 C57BL/6小鼠后 T细胞反应情况检 将上述各组免疫小鼠以相同方法和剂量加强一次免疫， 七天后进行 MTT法 T细 胞扩增实验， 具体方法如下： 在无菌条件下， 取脾制成单个细胞悬液， 用红细胞裂 解液去除红细胞， 然后用 PBS液洗三次， 再将细胞悬液通过无菌的玻璃棉柱以去除 B细胞， 进行细胞计数， 调整细胞浓度到 3 X 106个 /ml，将每组细胞悬液分 4份加入 96 孔平底细胞培养板中， 每份设置三个重复孔。 其中一份加入 20μ1 Con A (有丝 分裂原） 至终浓度为 l(^g/ml， 一份加入相应的特异性抗原 （Αβ42 ) 作为剌激物至 终浓度为 lO g/ml , —份不加剌激物， 一份加入 BSA至终浓度为 2 g/ml作为无关抗 原对照， 37°C温箱培养 72小时后， 每孔加入 20MTT至终浓度为 lmg/ml， 4小时后， 将 96孔板离心， 去掉上清， 每孔加入 150μ1二甲基亚砜 （DMS0) 使其完全溶解， 在酶标仪上读取 570nm处的 0D值， 结果计算： 剌激指数 SI= (各剌激孔的 OD值- 培养基 OD值） / (未剌激孔的 OD值-培养基 OD值） ， 结果显示， 两个鼠种免疫后 的 T细胞增殖实验显示 Co42组 SI剌激指数显著降低， 与单独免疫蛋白或 DNA组差 异很显著， P〈0. 03 (如图 7A和 B所示） 。
Αβ42蛋白疫苗与 DNA疫苗共免疫在老年 C57小鼠上的效果检测：
选用老年痴呆症小鼠模型 C57小鼠； 同时， 为验证由于动物在老化后， 其免疫 系统可能有所削弱， 免疫后是否仍然可以像在年轻小鼠上有相同作用， 因此选用了 1年 -1年 2月大的老年小鼠进行实验。
将 12只 1年龄左右的老年小鼠分为四组， 每组 3只； 第一组肌肉注射含 50微 克 pVAXl- Αβ42质粒 DNA的 PBS溶液 50微升； 第二组肌肉注射含一拷贝 Αβ42蛋白 50微克， 1/2体积弗氏完全佐剂乳化完全的蛋白抗原 50微升；第三组同时肌肉注射 含一拷贝 Αβ42蛋白 50微克， 1/2体积弗氏完全佐剂乳化完全的蛋白抗原 50微升以 及含 50微克 pVAXl- Αβ42质粒 DNA的 PBS溶液 50微升； 第四组为不处理的 Na'ive 组。 第 14天再以相同注射方式和剂量加强免疫一次， 在第二次免疫后 14天收集血 清， 用 ELI SA方法检测抗体 I gG水平， 实验孔的 0D值达到对照孔 0D值的两倍时认 为是阳性； 最后加强一次免疫， 7天后进行 MTT法 T细胞增殖检测。
结果显示， A为抗 Αβ42抗体 I gG滴度的比较， 共免疫 Co42组和单独免疫蛋白 组都能达到相当高的水平（至少 51200倍） ， B为 T细胞增殖结果， T细胞反应受到 抑制， 与单独免疫组相比较有显著性差异， P〈0. 05 (如图 8所示） 。
Αβ42蛋白疫苗与 DNA疫苗共免疫剂量检测：
本实施例进行不同剂量组合对 C57小鼠进行免疫， 确定 Αβ42蛋白疫苗与 DNA 疫苗共免疫的合适剂量。
将 21只 C57 8周龄雌性小鼠分为 7组， 每组 3只； 第一组肌肉注射含 100微 克 pVAXl- Αβ42质粒 DNA的 PBS溶液 100微升； 第二组肌肉注射含两拷贝 Αβ42蛋 白 100微克的 PBS溶液 100微升； 第三组同时肌肉注射含 100微克 pVAXl- Αβ42质 粒 DNA的 PBS溶液 200微升以及含两拷贝 Αβ42蛋白 100微克的 PBS溶液 100微升； 第四组同时肌肉注射含 100微克 pVAXl- Αβ42质粒 DNA的 PBS溶液 100微升以及含 两拷贝 Αβ42蛋白 100微克的 PBS溶液 100微升； 第五组同时肌肉注射含 100微克 pVAXl- Αβ42质粒 DNA的 PBS溶液 100微升以及含两拷贝 Αβ42蛋白 200微克的 PBS 溶液 100微升； 第六组同时肌肉注射含 300微克 pVAXl- Αβ42质粒 DNA的 PBS溶液 100微升以及含两拷贝 Αβ42蛋白 100微克的 PBS溶液 100微升；第七组为不处理的 Na'ive组。 第 14天再以相同注射方式和剂量加强免疫一次， 在第二次免疫后 14天 收集血清， 用 ELI SA方法检测抗体 I gG水平； 最后加强一次免疫， 7天后进行 MTT 法 T细胞增殖检测实验。
结果显示， 当 DNA免疫的剂量为 100μβ， 随着混入的蛋白量的增加， 抗 Αβ42 抗体浓度也是相应增高， 但 τ 细胞增殖却不是一个线性上升的趋势， 而是在 100 μδ?ΝΑ与 100 μδ Αβ42蛋白， 以及 100 μδ?ΝΑ与 200 μδ Αβ42蛋白混合时出现免 疫抑制， 且以 100 与 200 混合的情况为差异显著， p〈0. 05 (如图 9所示） 。 实施例 6
Αβ42抗原联合免疫长效性实验：
检测免疫后持续的免疫效果的长短， 对 Αβ42抗原的蛋白与 DNA联合免疫效果 的长效性进行评价。
将 16只 6-8周龄 BALB/c或 C57BL/6雌性小鼠分为 4组， 每组 4只。 第一组肌 肉注射含 100微克 pVAXl- Αβ42质粒 DNA的 PBS溶液 100微升； 第二组肌肉注射含 两拷贝 Αβ42蛋白 100微克的 PBS溶液 100微升； 第三组同时肌肉注射含 100微克 pVAXl- Αβ42质粒 DNA的 PBS溶液 100微升以及含两拷贝 Αβ42蛋白 100微克的 PBS 溶液 100微升； 第四组为不处理的 Na'ive组。 第 14天和第 28天再以相同注射方式 和剂量加强免疫二次， 在第三次免疫后 28天、 42天、 和 56天收集血清， 用 ELISA 方法检测抗体 IgG水平。 并在第最后一次采血后处死小鼠， 进行 MTT法 T细胞增殖 实验。
结果显示， 共免疫组最后一次免疫后到第 56天抗体低度有所下降， 但仍然处 于一个较高的水平： 128000 ; DNA免疫组抗体滴度一直很低 （如图 10A所示） ， 这 与 DNA免疫诱导主要 TH1反应的机理相关， 且与免疫剂量和未加免疫佐剂有关系。
T细胞增殖结果如图 10B所示， 联合免疫的免疫抑制持续存在， 在共免疫后相 当长一段时间内 T细胞一直未被激活。
抗血清与 Αβ纤维的结合能力检测：
研究表明， Αβ蛋白疫苗重要是通过机体产生的 Αβ抗体清除脑内 Αβ治病蛋白的 沉积， 从而减轻老年痴呆症患者的临床症状； 因此， 只有证明了可与 Αβ蛋白纤维有 效结合的抗体的存在才能说明此免疫产生的抗体在功能上有效。 为了证明本疫苗免 疫产生的抗 Αβ42的抗体的功能可与 Αβ结合， 本实施例应用以下的方法进行了间接 的验证：
一、 抗血清与 Αβ蛋白纤维结合的 Dot Blot检测：
将之前不同免疫组采集的血清 （同组小鼠的血清混合在一起） 按照一定低度稀 释，并点到硝酸纤维素膜上（每个低度点 3μ1 )；待液体完全干后，将膜放入含 2%BSA 的 TBS溶液中， 室温下摇晃封闭 40 用双蒸水洗 2次， 再用 1 X TBST洗一次； 将膜放入 Αβ40 蛋白 TBS稀释液中 （终浓度 l g/ml ) ， 室温下摇晃孵育 1小时； I X TBST洗三次，每次 5分钟；将膜放入 2D8 anti-Αβ antibody TBS稀释液中（1 : 1000 ) , 室温下摇晃孵育 1小时； 1 X TBST洗三次，每次 5分钟；将膜放入 α-His antibody-HRP TBS稀释液中 （1 : 2000 ) 室温下摇晃孵育 1小时； 1 X TBST洗三次， 每次 5分钟。 ECL显色。
结果如图 11A所示， 相同稀释度下， 200μβ蛋白与 lOO gDNA共免疫组结合的 Αβ 纤维 （F. L. I.提供） 最多， 其结合能力最强， 其次是 lOO g蛋白与 lOO gDNA共免 疫组， 再次是单独 100μ 蛋白， 最少的是单独 lOO gDNA组， B图是分析 Dot Blot 各点的密度的评分图。 Dot Blot结果与抗体 IgG滴度的结果相一致。
结果证明， Αβ42抗原免疫产生的抗体可有效地结合 Αβ蛋白纤维， 为其在体内有 效清除 Αβ治病蛋白奠定了基础。
二、 抗血清与 APP/PS1老年痴呆症转基因发病小鼠脑内 Αβ沉淀结合：
将 0. 4 mAPP/PSl老年痴呆症转基因发病小鼠的脑组织组织切片分别至于 24孔 板的各孔中， 个孔含 PBS。 清洗 2-3遍； 用 10% NGS， 0. 2%Triton X100 in PBS, 室 温封闭 1小时； 弃上清， PBS洗 3遍， 加入 1 : 200倍稀释后的来源于不同免疫组的 血清； 4度过夜孵育；移去上清， PBS洗 3遍，力口入 Goat anti mouse second antibody ( lable 488nm) 二抗稀释液 （1 : 1000 ) ， 室温避光孵育 1 小时； 移去上清， PBS 洗 3遍， 移去 PBS。 用 Dapi ( 1μδ/πι1 ) 复染， 每个组织滴加 2滴 Dapi溶液， 避光 2min, 迅速用 PBS洗 2次， 将组织移到载玻片上， 盖上盖玻片并封片； 电镜检测。
结果如图 12所示， 蓝色为 Dapi复染结果， 显示了细胞， 红色则为抗体与脑内 Αβ蛋白的结合情况， ΡΙ 为阴性血清组， 由于血清内无可以和 Αβ蛋白结合的抗体， 因此没有 Αβ斑点被染出来， 3552抗 Αβ单抗 （F. L. I.提供） 作为阳性对照， 可见病 鼠脑组织中无论是海马区， 还是大脑皮层有大量的 Αβ斑块。 实验组中， 含有 Αβ42 蛋白的免疫组的血清均可以染出大量的病灶斑块，表明血清中的针对 Αβ42的抗体能 和脑组织中的 Αβ蛋白结合， 功能显著； 单独免疫 DNA组， 由于抗体低度很低， 几乎 无 Αβ斑块染出。
实施例 8 细胞因子水平测定：
将 12只 6-8周龄 BALB/c或 C57BL/6雌性小鼠分为 4组， 每组 3只。 第一组肌 肉注射含 100微克 pVAXl- Αβ42质粒 DNA的 PBS溶液 100微升； 第二组肌肉注射含 两拷贝 Αβ42蛋白 100微克的 PBS溶液 100微升； 第三组同时肌肉注射含 100微克 pVAXl- Αβ42质粒 DNA的 PBS溶液 100微升以及含两拷贝 Αβ42蛋白 100微克的 PBS 溶液 100微升； 第四组为不处理的 Na'ive组。在第 14天， 以相同方法和剂量加强一 次免疫， 免疫后 7天进行细胞因子的 Rt-PCR检测及流式细胞检测。 所述的 Rt-PCR 检测方法如下： 取免疫后的小鼠断颈处死后取出脾脏， 提取总 RNA ( TRIZ0L, 鼎国 生物公司） ， 反转录为 cDNA，反转录依照大连宝生物公司 RNA RT-PCR 操作指南， 取纯化的 1μ 总 RNA置 250μ? 离心管中， 然后依次加入相关试剂： 4μ1 MgCl2， 2μ1 10 X缓冲液， 8· 5μ1 DEPC水， 2μ1 dNTP 混合物， 0· 5μ1 Rnase inhibitor, 0. 5 μ 1 M-MLV 反转录酶（Promage公司）， 0. 5 01 igo( dT)12引物；反应条件为 42°C 30min, 99 °C 5min， 5 °C 5min。 用看家基因次黄嘌吟磷酸核糖基转移酶 （HPRT ) 为内源表 达标准， 进行 PCR扩扩增， 将各组 cDNA浓度调为一致， 再进行其他细胞因子的 PCR 扩增， 其中， 反应所需引物和 PCR反应条件如表 1所示。
表 1. HPRT, TGFp和 IL-10的引物序列及 PCR反应参数
胞内细胞因子染色方法检测细胞因子方法如下： 免疫小鼠脾脏无菌分离出的 τ 细胞在 10%的培养基中并稀释成 I X 107mL 个细胞， 往 96细胞板里加 100uL， 同时 加入终浓度为 10ug/mL的抗原， 可以加入共剌激信号终浓度 10ug/mL CD28的单抗， 混匀后， 37°C， 5%二氧化碳培养， 剌激 4-6小时后加 2UL/孔的 monensin蛋白转运 抑制剂； monensin处理 2小时后， 用 2mL的 PBS 2000rpm离心 5分钟， 将细胞重悬 于 50uL的 PBS中； 加入 Fc受体抗体 1. Ομ? ( 0. 5mg/ml ) ， 封闭 Fc受体， 冰浴中 20min， 力 B 2_4ml PBS, 2000rpm离心 5min， 弃上清， 50 lPBS悬浮细胞； 将细胞重 悬 200ul 的加 4%的多聚甲醛 PBS溶液， 室温孵育 10-15 分钟， 用 2_4mL 的 PBS 2000rpm离心 5分钟； 将细胞重悬于 200μ1 0. 1%的皂素， 4°C 孵育 7分钟， 用 2_4mL 的 PBS 2000rpm离心 5min， 50μ1ΡΒ5悬浮细胞； 加入适量直标细胞因子荧光抗体及 表面分子抗体， 冰浴 30min， 加 2_4ml PBS， 2000rpm离心 5min， 弃上清； 上样前处 理： 取 300-400μ1 PBS重悬细胞， 将细胞悬液用 200 目铜网过滤入 FACS专用管中， 进行仪器检测和分析。
结果如图 13A 所示， CD4-IFNY在免疫组中变化不明显， Αβ42 蛋白免疫组的 CD4-IL4表达量较高， IL4与炎症反应关系密切， 而当 Αβ42蛋白与 DNA共免疫后， IL4 的表达量降低， 表明共免疫抑制 IL4 的表达， 与抑制炎症反应相关； 另外， CD4-IL10和 foxp3在蛋白与 DNA共免疫组内都高表达，免疫抑制的发生与诱导出了 高表达 foxp3和 IL10的 T调节性 T细胞有关， 且 RT-PCR的结果如图 11B所示， 依 然显示了 T细胞高表达 IL10和 TGFp。
免疫小鼠脑组织中 CD4+T细胞免疫组化染色情况：
小鼠的脑组织来源于前面实施 4中的老年小鼠不同免疫组，采用免疫组化 SABC 法进行组织切片染色， 方法如下： 包埋组织： 先在铁模具中加入一些液态石蜡， 先 稍微冷却， 然后再将以用 4%甲醛固定的脑组织组织置于石蜡之中， 排列整齐， 再将 塑料模具盒盖上， 最后加入少许液体石蜡， 进行冷冻， 使石蜡变成固态； 切片： 将 包埋好的组织从模具上取下来， 并置于石蜡切片机上， 切片机通过调节上下左右来 来使组织和切割方向一致， 然后调节切片的厚度 （5μπι) ， 用毛笔将切割的载玻片 向外拉， 并用小镊子将包含有完整组织的载玻片置于 40度温水中； 捞组织： 当组织 载玻片置于 40度温水中之前，赶走水浴中的气泡，组织受热展开，用载玻片捞组织， 放入 37度温箱中烘干； 脱蜡： 依次将载玻片放入二甲苯-二甲苯 -100%酒精 -100%酒 精 -95%酒精 -90%酒精 -80%酒精 -70%酒精，在每个试剂中放 lO 高压锅抗原修复： 脱蜡后在清水中冲洗一段时间， 加入 3% 02浸泡 10 min， 从而除去内源性的过氧化 氢酶， 然后倒掉 02， 在清水中洗两次， 再加入柠檬酸缓冲液， 放入高压锅中 120 度 10min， 目的是为了使抗原的位点暴露出来； 血清封闭： 冷却至室温后， 将柠檬 酸缓冲液倒掉， 水洗 2次， 并将载玻片置于 PBS中 5 min， 洗 2次， 擦干组织周围 的 PBS液， 马上加上血清， 使一些非特异性的位点封闭起来， 然后放入 37 度温箱 中半小时。 血清稀释 10倍 （900μ1 PBS : ΙΟΟμΙ血清封闭液） ； 加一抗： 将温箱中 的载玻片取出， 用吸水纸擦干载玻片反面和正面组织周围的血清， 加一抗 CD4抗体 ( Rat 来源） ， 4 度冰箱中保存过夜； 加二抗： 将载玻片从冰箱中取出， 放入 PBS 中洗 3次， 每次 5min， 擦干组织周围的 PBS后加上二抗（HRP_ant i_Rat抗体） ， 然 后置于 37度温箱中半小时； 加 SABC: 将片子从温箱中取出， 放入 PBS中洗 3次， 每次 5min， 擦干组织周围的 PBS后加上 SABC , 然后置于 37度温箱中半小时。 SABC 稀释 100倍 （990μ1 ΡΒ5 : ΙΟμΙ SABC ) ； 加显色剂： 将片子从温箱中取出， 放入 PBS 中洗 3次， 每次 5min， 擦干组织周围的 PBS后加上显色剂。 （显色剂的配置： 在 lml 水中加 1滴显色剂 A， 摇匀， 然后加 1滴显色剂 B， 摇匀， 再加 1滴显色剂 C， 摇匀） A: DAB B : H202 C: 磷酸缓冲液； 脱水： 将片子置于水中冲洗后， 依次将载玻片放 入 70%酒精 -80%酒精 -90%酒精 -95%酒精 -100%酒精 -100%酒精 -二甲苯-二甲苯。 每个 试剂中放置 2min， 最后浸泡在二甲苯中， 搬到通风柜中； 封片： 用中性树胶滴在组 织旁边， 再用盖玻片盖上。
目前， Αβ蛋白老年痴呆症疫苗的研制暂时搁置， 是因为二期临床中发现了 5% 的患者伴随脑膜炎副作用， 研究进一步发现这种脑膜脑炎是因为 Τ淋巴细胞侵入脑 中， 造成炎症， 也有研究在实验动物免疫蛋白疫苗后， 应用免疫组化染色的方法， 发现了脑内有淋巴细胞存在， 因此， 本实施例中， 检测了 CD4+T细胞在脑中的情况， 用以证实本发明的老年痴呆症疫苗抑制脑膜炎副作用。
结果如图 14所示， 虽然在组织切片中没有发现大量的 CD4细胞浸润， 但在单 独免疫蛋白组的脑切片中血管内， 或血管附近都发现了少量阳性细胞（箭头所指）， 单独免疫 DNA组切片也显示了一些阳性细胞， 可能与 DNA疫苗产生比较强的 Th l型 T细胞反应有关； 在 Naive阴性对照组， 脑血管内及其周围都未见异常， Αβ蛋白与 DNA共免疫组则同样未见阳性 Τ细胞出现； 结果表明， Αβ蛋白与 DNA联合免疫的疫 苗能有效防止副反应脑膜炎的发生。
Αβ 42蛋白与 DNA共免疫 ΑΡΡ老年痴呆症模型小鼠结果：
将 1 1月龄雄性 APP转基因小鼠分为四组， 每组 3只。 第一组肌肉注射含 100 微克 pVAXl- Αβ42质粒 DNA的 PBS溶液 100微升； 第二组肌肉注射含两拷贝 Αβ42 蛋白 100微克的 PBS溶液 100微升； 第三组同时肌肉注射含 100微克 pVAXl- Αβ42 质粒 DNA的 PBS溶液 100微升以及含两拷贝 Αβ42蛋白 200微克的 PBS溶液 100微 升； 第四组为不处理的 Na'ive组。 在第 14天和第 28天以相同方法和剂量加强一次 免疫， 第 30-35天进行水迷宫实验， 第 36天进行 El i sa方法检测抗体实验和 MTT 法 T细胞增殖实验。 水迷宫实验方法： 人工将水迷宫划为四个象限， 将平台定为第 五象限， 让每只小鼠从每个象限中心点 1， 2， 3， 4背向水迷宫入水， 若在一分钟内 找到平台则停止实验， 一分钟时找不到平台也自动停止实验， 然后计算四次平均时 间作为当天的寻找时间； 第六天时拿出平台， 让小鼠每次游一分钟， 计算在第四象 限内的平均停留时间； 结果显示， Αβ 42蛋白与 DNA共免疫 ΑΡΡ老年痴呆症模型小 鼠能够明显改善其记忆障碍。
上述实验结果表明， 本发明利用原核表达的 A 42蛋白抗原与 pVAX-A 42质粒 共免疫， 能产生高水平的抗 A 抗体 IgG， 同时引起了 T细胞反应的抑制， 且可持续相 当长一段时间；所述共免疫产生的针对 A 的抗体具有结合 A 蛋白纤维以及 APP/PS1 老年痴呆症转基因发病小鼠脑内天然 A 蛋白沉淀的功能， 显示其清除 A 沉淀的能 力； 本疫苗是一种极具潜力的、 有效的、 无副作用的疫苗， 可用于预防、 治疗老年 痴呆症。
老年痴呆症 Αβ40蛋白疫苗与 DNA疫苗联合免疫效果实验
老年痴呆症 Αβ40核酸疫苗的制备如下：
一、 老年痴呆症 Αβ40真核表达质粒的构建：
以质粒 ΡνΑΧ-Αβ42为模板，
在引物 Ρ : 5 ' - GGCGGATCCATGGATGCAGAATTCCGACATG -3 ' 禾卩引物 P2 '： 5 ' - GGCAGATCTTTAGTACCACCCGCCACAACAG _3， ， （在弓 |物 禾口弓 |物 2， ， 分另 ij弓 |入 BamHI 识别位点和 Xbal识别位点） 的引导下 PCR扩增 A 42基因。 反应体系： 1 μ L质 粒模板， 引物 1和引物 2各 lOpmol , 500mM KCl , lOOmM Tri s-HCl ( pH8. 4 ) ， 1. 5mM MgC12， 100 μ g/mL BSA, ImM dNTPs , 2. 5U Taq DNA聚合酶， 总体积为 25 L。 反应 条件为： 94°C 变性 30秒， 60 °C 复性 30秒， 72 °C 延伸 30秒， 共 30个循环。 再 将在 1. 5%脂糖凝胶电泳中的 DNA扩增片段回收， 将目的基因以 BamHI和 Xbal双酶 切， 回收脂糖凝胶电泳中的 DNA基因片段， 连接于 pVAXl ( invitrogen ) 真核表达 载体上。 将连接产物转化入 DH5a细菌感受态细胞， Kanar抗生素 LB固体培养基筛 选阳性菌落， 提取质粒， 以 BamHl和 Xbal酶切鉴定结果如图 1C所示， 箭头所指即 为目的片段。 且经序列分析后 Αβ40基因序列完全正确。
二、 老年痴呆症 Αβ40质粒在真核细胞中的表达：
利用脂质体法将 ΡνΑΧ1-Αβ40 转染 ΒΗΚ 细胞系， 48 小时候收获细胞， 提取总蛋白 ( RIPA, 鼎国生物公司） ， 进行 Western-blot实验，验证真核表达，如图 2Β所示， 转染了 ΡνΑΧ1-Αβ40质粒组的细胞通过 Western-blot杂出了目的条带，阴性对照（-) 为不加 ΡνΑΧ1-Αβ40 反应组， 阳性对照 （+ ) 为商业化 Αβ42 多肽作对照， Ab40 为 ΡνΑΧ1-Αβ40转染 ΒΗΚ细胞系。
为了检测 Αβ40蛋白疫苗（上海科肽， Αβ40多肽合成）与 DNA疫苗联合免疫是否 能够引起免疫抑制， 且同时不影响抗体的产生， 选择了 6-8周龄的 C57BL/6小鼠进 行免疫， 通过抗体 IgG和 Τ细胞增殖反应的检测， 来回答上述问题。
1 ) 、 Αβ40蛋白疫苗与 DNA疫苗联合免疫 C57BL/6小鼠后产生抗体情况的 ELISA检 将 24只 6-8周龄 C57BL/6雌性小鼠分为 8组， 每组 3只。 第一组肌肉注射含 100微克 pVAXl- Αβ40质粒 DNA的 PBS溶液 100微升； 第二组皮下免疫含 Αβ40蛋白 100微克， 1/2体积弗氏完全佐剂乳化完全的蛋白抗原 100微升；第三组同时皮下免 疫含 Αβ40蛋白 100微克及含 100微克 pVAXl- Αβ40质粒 DNA的 PBS溶液 100微升； 第四组同时皮下免疫含 Αβ40蛋白 200微克及含 100微克 pVAXl- Αβ40质粒 DNA的 PBS溶液 100微升； 第五组同时皮下免疫含 Αβ40蛋白 300微克及含 100微克 pVAXl- Αβ40质粒 DNA的 PBS溶液 100微升； 第六组同时皮下免疫含 Αβ40蛋白 100微克及 含 200微克 pVAXl- Αβ40质粒 DNA的 PBS溶液 100微升； 第七组同时皮下免疫含 Αβ40 蛋白 100微克及含 300微克 pVAXl- Αβ40质粒 DNA的 PBS溶液 100微升；第八组为 不处理的 Na'ive组。第 14天再以相同注射方式和剂量加强免疫一次，取第二次免疫 后 14天、 28天的血清用 ELISA法测定其抗体滴度， 检测方法为： 将 96孔酶标板用 10ug/ml Αβ42 蛋白抗原包被， 4°C过夜， 3%小牛血清 37 °C封闭 1 PBST ( 0. 05% Tween20 溶于 PBS ) 洗涤 3次， 每次 5分钟； 加入不同稀释度的免疫小鼠血清， 以 未免疫的小鼠血清作对照， 37 °C孵育 1小时； PBST洗板三次后， 每孔辣根过氧化物 酶标记的羊抗小鼠 IgG (二抗， Si gma, St. Loui s) ΙΟΟμΙ , 37 °C孵育 1小时后弃去， PBST洗涤 3次， 每次 5分钟； PBST洗三次， 加入底物 TMB液 ΙΟΟμΙ， 室温显色反应 20分钟， 2Μ硫酸中止反应， 用酶标仪测定 0D45。/62。光密度值。 Balb/c小鼠结果如图 6a所示， 二免后 14天血清和 28天血清的 IgG稀释了 400后的 0D值的比较， 显示 Co42共免疫组较高， C57小鼠如图 9C C57小鼠免疫后抗 Αβ42抗体 I gG检测结果所 示， 结果与前者相似。
2 ) 、 Αβ40蛋白疫苗与 DNA疫苗联合免疫 C57BL/6小鼠后 T细胞反应情况检测： 将上述各组免疫小鼠以相同方法和剂量加强一次免疫， 七天后进行 ΜΤΤ法 Τ细 胞扩增实验， 具体方法如下： 在无菌条件下， 取脾制成单个细胞悬液， 用红细胞裂 解液去除红细胞， 然后用 PBS液洗三次， 再将细胞悬液通过无菌的玻璃棉柱以去除 Β细胞， 进行细胞计数， 调整细胞浓度到 3 Χ 106个 /ml，将每组细胞悬液分 4份加入 96孔平底细胞培养板中， 每份设置三个重复孔。 其中一份加入 2(^l ant i-CD3至终 浓度为 l g/ml，一份加入相应的特异性抗原（Αβ42 )作为剌激物至终浓度为 10μ /πι1， 一份不加剌激物， 一份加入 BSA至终浓度为 2 g/ml作为无关抗原对照， 37 °C温箱 培养 72小时后， 每孔加入 20MTT至终浓度为 lmg/ml， 4小时后， 将 96孔板离心， 去掉上清，每孔加入 150μ1二甲基亚砜（DMS0 )使其完全溶解，在酶标仪上读取 570nm 处的 0D值， 结果计算： 剌激指数 SI= (各剌激孔的 OD值-培养基 OD值） I (未剌 激孔的 OD值-培养基 OD值） 。 结果如图 9D C57小鼠免疫后 T细胞增殖实验结果 所示， 两个鼠种免疫后的 T细胞增殖实验显示 ant i-CD3组 SI剌激指数显著降低， 与单独免疫蛋白或 DNA组差异很显著 （p〈0. 03 ) 。
Αβ40蛋白疫苗与 DNA疫苗联合免疫虽然不影响抗体的产生，但是引起免疫抑制 的效果较差，并不适宜采用为共免疫免疫的最佳组分。
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