SDS-PAGE后的sdspage条带歪了去质谱多少钱

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关于构建pET28a载体转化后IPTG诱导跑SDS-PAGE胶问题。
试验进行到了IPTG诱导表达后跑SDS-PAGE胶的环节,但是试了很多次了一直失败,我想了很多原因但是都没成功,跪求各位大神给我点指导,再做不出来毕不了业了。:cry::cry::cry::cry::cry::cry::cry::cry::cry::cry::cry::cry::cry:
首先,我获得了我的目的基因,与pET28a连接后,成功构建载体。我进行了菌液PCR验证,质粒PCR验证,质粒双酶切验证,之后是送去测序。所有的结果足够表明我已经构建载体成功了。
之后就是转化BL21表达菌株中。转到BL21表达菌株时间大概是15年1月份左右,直到过年后回来开始摇菌,诱导,跑胶,问题就是这时候出现的。
以下是我做试验的整个流程,望大神给些建议。
   1、诱导与提取目的蛋白
   ① 菌种活化。重组载体pET-28a-SAMDC和空质粒pET-28a的单菌落,分别接种于25mL LB液体培养基(KanR)的试管中,37℃,180r/min,过夜振荡培养。
   ② 菌种扩培。取活化好的菌种按1%的量接种于100mL的LB液体培养基(KanR),摇匀,37℃,200r/min,振荡培养3h。
   ③ 融合蛋白的诱导表达。向菌液中分别加入终浓度的IPTG(0.1、0.5、1.0 mmol/L)作诱导剂,37℃,180r/min,振荡培养4h(3、4、5、6h)。
④ 目的蛋白的提取。
A. 经诱导后取1mL菌液,4℃ 12000g,10min收集菌体;吸出菌液,用0.5mL预冷的50mmol/LTris-Cl(pH7.4)漩涡振荡使沉淀的菌体复悬,4℃ 12000g,离心10min;再次吸出上清液,小心地吸净管壁上的液滴,尽可能地使沉淀不带有残留的液体;加入100uL ddH2O,漩涡振荡使沉淀复悬,一旦菌体分散开来立即加入等体积的1%×SDS磷酸缓冲液,继续振荡20s;超声波处理。超声处理为7min,超3s,停10s,功率为75w。超声波处理后,样品4℃ 12000g,10min,将上清移至另一管中,沉淀用少量1%SDS溶解,分别加入等体积的2×SDS凝胶上样缓冲液;快速离心,将菌悬液收集在离心管底部,沸水浴中放置5min;分别取15uL样品进行SDS-PAGE电泳检测。
图片即为SDS胶跑完后的状态。我的蛋白预测应该是在40kDa左右,可是在40kDa左右处根本没有我的目的蛋白。反而在30kDa处出现奇怪的条带...
做了几次都是这样的状态。同实验室的也有人在做这一步,她的蛋白预测大小为38kDa,但是跑出来的胶跟我的一模一样。
还有一个同学她是前两次做成功了可以明显看到目的蛋白表达,在60kDa左右,但是从大概4月份开始条带就没有了,我们一直找不到原因,难道这个也是可以传染的?
去问实验室的小老师,老师说可能是我们IPTG诱导的时间有问题,但是按照他说的方法重新试了也不行。难道是因为驯化时间太久所以BL21这个菌太淘气了所以把我们的载体吐出去了?但是这种可能性也不算大啊,我们也没有反复冻融,更何况我们重新验证了,BL21菌株中确实有我们的质粒。现在真的是想不出来到底问题出在哪里。唯一能想到的就是IPTG失效了,下次准备把所有的试剂都重新配一遍,再重新来一次。还有别的什么原因会出现这样的情况么?如果胶做的不对会使条带消失么??求!!!!!!!!跪求!!!!!!!!谢谢大家了。
IMG_1062.JPG
是什么样的没区别,图上注释一下呗,那个是个,看你这菌是有目的条带的呀。
你好,都有哪些原因可以导致整个序列载体本身不表达呢?那如果不可以的话我需要更换菌株么?
从下到上条带顺序依次是:Marker(94kDa,66.2,45,33,26)、转空载体、转SAMDC基因0.1mM IPTG诱导总蛋白,转SAMDC基因0.1mM IPTG诱导上清蛋白、转SAMDC基因0.1mM IPTG诱导沉淀蛋白、转SAMDC基因0.5mM IPTG诱导总蛋白、转SAMDC基因0.5mM IPTG诱导上清蛋白、转SAMDC基因0.5mM IPTG诱导沉淀蛋白、转SAMDC基因1mM IPTG诱导总蛋白、转SAMDC基因1mM IPTG诱导上清蛋白、转SAMDC基因1mM IPTG诱导沉淀蛋白。
33kDa左右处确实是有一条条带,但是大小与我预测的不相符。我的预测大小是40kDa左右,我同学预测大小是38kDa左右,我们俩同时跑胶跑出来的东西是一模一样的,无论是条带的大小,还是条带的颜色深浅,甚至是位置...
变性缓冲液&&5×
这就说来话长了,,本身序列的问题,在怎么优化条件还是不会表达,如果序列没有问题,那就要不断尝试摸索各个条件,比如载体、宿主菌、表达条件 试剂浓度等等
空载体的沉淀那,有跑过吗?你的蛋白在沉淀里,大小为36——38左右,由图可见,不是33。0.1mM———1mM IPTG都能表达。
加做个空载体0.5mM IPTG诱诱导跑下沉淀,你就知道了,到底有没有表达。
你好,我做的空载体的确是没有分总蛋白上清蛋白和沉淀,根据你的建议我要去试试...:rol::rol:但是,不是空载体的菌诱导后都分了上清和沉淀来跑胶在沉淀里面的确是出现了类似于目的蛋白的奇怪条带。我弱弱的问一嘴,如果是包涵体的话我40kDa左右的条带会可能在这个位置嘛?
在33KD靠上一点,大概35KD的带是完全有可能是你的蛋白的~只要做一个空载的全细胞和沉淀就一目了然了
想先跑SDS后切胶,胶内酶解后上质谱。因为当初就是这么设计的实验技术路线啊。哭死。
你好&&我做了空载体的0.5mM IPTG诱导 总蛋白&&上清 沉淀这次都跑了 空载体跑出的图片跟基因连接后的没有区别&&很揪心...&&可以说明我的蛋白根本就没有表达么?到目前为止我仍然没有找到原因...需要重新开始了...
细胞沉淀里的那条带在空载体里仍然存在...
超声完以后直接取样品就是总蛋白。之后离心,取上清就是上清样品,取沉淀就是沉淀样品...我们重新制作了感受态重新转化诱导之后还是不行。但是你说如果DE3区段出现变化为什么我一个同学她前两次做成功了之后就不行了呢?太纠结了...
既然空载和你的重组质粒的菌都有那条比较明显的带,那总蛋白和上清在你的目的蛋白附近是否有差异?如果没有差别那我可以理解为:你的蛋白根本没有表达,所以下一步的工作就是如何让蛋白表达。
可能的问题无外乎以下几个方面:
基因相关的问题:1.你用于诱导的菌所含载体上是否还有你的基因,从你现在用于诱导的BL21里面提个质粒看看大小对不对?你其他两个同学也出不来蛋白,要不你们一起做一下筛查?2.你的基因是否插入到正确的位置,28a酶切位点选择不合适会出现移码的,再看看你的酶切位点和前端标签的读码框是否一致?你的基因序列是否正确,把测序结果再看看,特别是载体和基因连接处有没有问题?
载体的问题:1.给公司测个序看看多克隆位点前端有没有问题,28a多克隆位点前面好几个标签呢,从rbs序列开始往后测序看看前端序列是不是有问题,前端标签有没有移码?rbs序列正常不正常?T7启动子序列正常不正常?2.28a前端那么多标签有没有把这些序列加起来算一下蛋白的大小?
宿主菌的问题本身就很复杂,也不好筛查,一般实验室大面积集体诱导不出蛋白才会考虑是否是菌株出现的问题,很多实验室的BL21(DE3)用的时间长了确实会出现一些所谓的菌株活力下降的问题。解决方法就是接最初保存的那种甘油管划线活化之后重新转化。也有实验室出现过宿主BL21(DE3)污染空载质粒的,还有染菌的,还有就是DE3区段出的问题,筛查起来非常麻烦。后两种情况一般都是不再用本实验室的菌株,向外面实验室接点确定没问题的BL21来用一用。
蛋白本身的问题:如果上述情况你们确定都没问题的话,找一本大肠稀有密码子表对照一下看看有没有大量、连续的稀有密码子出现?要不换换Rocetta(DE3)来试一试?你们的蛋白来源是哪里,主要功能是什么?是否会对代谢产生影响?你们实验室出问题那几个学生做的蛋白是否功能相近?
我认为可以换个菌株来看看,至于诱导条件,我建议30度,200rpm 1mM IPTG 直接过夜诱导个12小时看看情况,出来包涵体也不怕,关键看看能不能出蛋白。
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扫描下载送金币毕赤酵母表达后跑SDS-PAGE出现奇怪的条带 - 实验交流 - 生物秀
标题: 毕赤酵母表达后跑SDS-PAGE出现奇怪的条带
摘要: [毕赤酵母表达后跑SDS-PAGE出现奇怪的条带] 我用毕赤酵母X-33表达大小约为66KD的糖化酶,诱导7天后,将上清经过TCA浓缩后跑SDS-PAGE,在预期的位置没有出现目的条带,但在大约100多KD处却出现了一条比较浓的带,量也较大,并且空白对照没有此条带。因为怀疑是由于二硫键形成的二聚体,所以我又用巯基乙醇将样品处理了一下,基本上没有这条带 关键词:[条带 毕赤酵母表达 SDS-PAGE 空白对照 培养基 甲醇 酵母 浓缩]……
我用毕赤酵母X-33表达大小约为66KD的糖化酶,诱导7天后,将上清经过TCA浓缩后跑SDS-PAGE,在预期的位置没有出现目的条带,但在大约100多KD处却出现了一条比较浓的带,量也较大,并且空白对照没有此条带。因为怀疑是由于二硫键形成的二聚体,所以我又用巯基乙醇将样品处理了一下,基本上没有这条带了,只能看到比较模糊的印,但是依然没有我想要的目的条带。这个奇怪的现象困扰了我很久,问过很多人都无法解释。如果说这条带是酵母自身分泌的蛋白,那为什么空白对照就没有呢?而且毕赤酵母表达时,目的蛋白如果有表达的话,应该占到总蛋白的90%左右,以这条带的量来看,我感觉不会是背景蛋白,什么背景蛋白会占这么大的优势,达到这么大的量呢?我感觉这就是特异带,因为空白对照明显没有此带,但是它的位置就是不对!请各位酵母表达的高手指点我一下!回复
可能是被修饰了,你最好是吧电泳图传一份上来看看
诱导7天后,将上清经过TCA浓缩后跑SDS-PAGE,
如果说这条带是酵母自身分泌的蛋白,那为什么空白对照就没有呢?
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空白对照是什么?未诱导的上清?是否和诱导上清一样经过了TCA浓缩?
而且毕赤酵母表达时,目的蛋白如果有表达的话,应该占到总蛋白的90%左右,
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说说而已。
一般毕氏酵母自身分泌的蛋白是不多。
但表达的外源蛋白,在我们通常的表达水平下,也绝对达不到总蛋白的90%。
没有经过巯基乙醇处理的那张电泳图没有留底,有的这张是经过处理之后的,就是每900微升样品里加了10微升的巯基乙醇,然后才进行的TCA浓缩,这张图从右至左依次是蛋白Marker,空白对照,空白对照,168h,144h,120h,96h,72h,48h,24h。现在这张图中那条带已经看不太清楚了,原来那张照片中,那条奇怪的带特别浓。说明一下,我的空白对照是转化了空质粒载体的酵母菌,一样的条件下同时进行的诱导,同样经过了TCA浓缩。我把照片发上来,请老师们帮我分析一下。
我说错了,是从左至右,不是从右至左,最上面那条Marcker应该是97KD左右。
原来那条奇怪的带就是我用红色圈出来的位置。
另外,我还有个问题要问一下各位老师,我这次又重新进行了一次诱导,这次我是严格按照毕赤酵母表达手册上做的,就是我先用50mL含甘油的培养基将酵母菌养到OD约为4左右,然后用原培养体积5分之一的含有甲醇的诱导培养基将菌体沉淀重悬,也就是10mL,使使OD值在20左右,然后开始诱导表达,但是因为我出了跑胶,还要进行酶活的测定,所以我每天取样2mL。但这样的话,再算上培养基每天蒸发的量,估计还没有诱导完,发酵液就干了。所以我每天在取样2mL后,又补加2mL左右的培养基,也就是说让培养基的体积基本保持在10mL ,然后添加10mL的0.5%的甲醇。考虑到补加的培养基中叶含有甲醇,我怕补多了,所以就配了不含有甲醇的诱导培养基。但有的人说,补加培养基很不好,会对蛋白的表达产生不利的影响,是这样吗?那是不是说我这一次依旧表达不出来呢?
从你的电泳图上看,24-48小时表达应该是可以的了。是外泌表达还是什么?如果是外泌表达的话也太不纯了。糖化的程度怎么样?如果高糖化的话,电泳完全有可能跑的很慢,不能用marker来确定蛋白。
在这次表达之后,我觉得是没有表达,所以又重新诱导了一次,上次我采用的是Mut+的诱导方案,我这次采用的是Muts的诱导方案,结果又出现了这条奇怪的带,我用的是毕赤酵母分泌表达一个大约66KD的糖化酶,这次的带很漂亮,但是比我的目标蛋白也大太多了,但我用软件分析了一下,我的蛋白中并无糖基化位点啊,但我觉得应该不是酵母自身的蛋白,因为自身蛋白怎么会有这么高的浓度啊!而且带这么明显,也很单一,并且还挺符合酵母诱导的规律,72h和96h的时候量很大。下面的图就是我这次新诱导的蛋白电泳图,从左到右依次是24h、48h、72h、96h、120h、144h、空白对照和Marcker(最上面的是97KD)。我现在实验已经无法进行下去了,因为根本找不到原因,也根本无法确定我的蛋白是不是表达了,现在根本就不知道这条奇怪的带是什么,真的很着急,请高手指点我一下!
有没有再检查一下你的测序结果,看起始和终止位点是否正确;是否有该蛋白的抗体,可作一下免疫检测;胶浓度多少,确定Marker的可信度吗?只跑出了5条,这种marker一般是6条的呀
Marker 应该是没有问题的,我又看了一下说明书就是5条带,依次是97、66、42、31和14KD。胶是12.5%,上次我跑10%的胶也是这个结果。我还想补充说明一下,我在诱导表达之前,用转化得到的阳性转化子在可溶性淀粉平板上进行了诱导表达,就是每天往平皿盖上添加甲醇诱导,诱导5天之后,用碘液进行染色。因为我的糖化酶是淀粉酶,如果酶已经表达并且有活性的话,就会出现透明圈。当时我的转化子都出现了水解淀粉的透明圈,而且还挺大的。如果我的表达质粒或基因出现了问题,那为什么转化子会有酶活呢?您说有没有可能性是我的蛋白没有分泌出来,还在菌体沉淀中呢?
我认为解决方案有如下几个方面:
1、如果转入空载体的不表达那条带,就将你电泳中那条带切下来,找公司做质谱分析(也不贵),看是否为目的蛋白?如果是,那就一切都解决了。如果不是,再做其它分析。
2、如果你不想花钱,就超滤浓缩发酵上清,跑PAGE,将那条最浓的带切下,做酶活性检测。3、你这种摇瓶或试管法发酵只能是碰运气,如果有发酵罐(带溶氧检测和酸度检测系统的),那就简单多了。
希望有帮助。
谢谢您的解答,我需要再和老板商量一下,因为我的课题只是摇瓶发酵水平,一个是我的课题不是很重要,老板不准备投入太多,而且我们实验室也没有发酵罐,根本不具备条件。
Marker 应该是没有问题的,我又看了一下说明书就是5条带,依次是97、66、42、31和14KD。胶是12.5%,上次我跑10%的胶也是这个结果。我还想补充说明一下,我在诱导表达之前,用转化得到的阳性转化子在可溶性淀粉平板上进行了诱导表达,就是每天往平皿盖上添加甲醇诱导,诱导5天之后,用碘液进行染色。因为我的糖化酶是淀粉酶,如果酶已经表达并且有活性的话,就会出现透明圈。当时我的转化子都出现了水解淀粉的透明圈,而且还挺大的。如果我的表达质粒或基因出现了问题,那为什么转化子会有酶活呢?您说有没有可能性是我的蛋白没有分泌出来,还在菌体沉淀中呢
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毕赤酵母自身也会产生降解类的物质,所以有透明圈也可能是酵母自身的。
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电话:021-多肽的质谱结果解析 - 实验交流 - 生物秀
标题: 多肽的质谱结果解析
摘要: [多肽的质谱结果解析] 各位大侠 我的蛋白一级序列清楚 将其酶解后取得酶解产物,经过凝胶层析和制备液相两步分离后 经过活性筛选 选择了制备液相显示是单峰的一个组分 用分析液相分析大约显示3个主峰 对该部分分别打了MALDI-TOF 和HPLC-MS-MS 问题1:两个仪器出来的结果对肽段分子量分析结果差别很大 到底以那个 关键词:[质谱 酶解 分子量 数据库 条带]……
各位大侠 我的蛋白一级序列清楚 将其酶解后取得酶解产物,经过凝胶层析和制备液相两步分离后 经过活性筛选 选择了制备液相显示是单峰的一个组分 用分析液相分析大约显示3个主峰 对该部分分别打了MALDI-TOF 和HPLC-MS-MS 问题1:两个仪器出来的结果对肽段分子量分析结果差别很大 到底以那个为准?
2:由于样品有限没有办法继续分离了 又不是很纯 没有办法做氨基酸序列分析,请问这两种方法(或其中一种)得到的结果怎么能通过软件分析得到肽段对应的是蛋白的那一段序列呢(很着急 请多多帮助 先多谢了啊)?回复
首先MALDI-TOF-MS/MS分析酶解产物不需要纯化。
两个仪器出来的结果对肽段分子量分析结果差别很大。这个问题可能是你仪器没有校正,尤其是MALDI。
由于样品有限没有办法继续分离了 又不是很纯 没有办法做氨基酸序列分析,请问这两种方法(或其中一种)得到的结果怎么能通过软件分析得到肽段对应的是蛋白的那一段序列呢(很着急 请多多帮助 先多谢了啊)?把你的二级质谱数据上网搜库就行。
感谢啊 不知道是哪个二级质谱数据库 我刚开始做 对该体系不是很了解 还望不厌其烦 多谢了
1. 你说的nMALDI和LC-ESI-MSMS分子量不一样,是正常的,MALDI上肽是单电荷,将质荷比减去1就是肽的分子量,ESI上肽会带2个或3个电荷,分子量应该是质荷比乘以2或3再减去2或3.你方便的话可以把质谱图贴上来给你看看。
2. 无论MALDI还是ESI应该主峰是一样的(看分子量,不是质谱图上的质荷比),然后要选择出来做二级,通过二级质谱就可以推断其系列。或者你可以参考楼上说的做个数据库检索就知道了。
3.你把问题弄复杂化了,最简单的方法是跑SDS-PAGE,然后把目标条带切下来做酶解,上MALDI做一级质谱(肽指纹谱),然后将这个蛋白的序列做理论酶解和MALDI测出来的一级图进行匹配,看质谱出来的是不是你的目标蛋白。网上有专门的工具来计算一个蛋白质的理论酶解肽,SwissProt上有。
3.跑SDS-PAGE 我跑过 分子量小于10KD 的基本上没分开 再者 条带比较多 另外 分子量较小的是否就无法鉴定了呢 下面我把我的谱图上传 请帮助分析一下 非常感谢啊
你不是说你的蛋白一级序列你知道吗,那你从条带上找相应位置的蛋白,切下来酶解,在做LC-MSMS啊。
我看了你的质谱图,MALDI的是只做了线性分子量,并没有MSMS,又加上你的蛋白不是纯的,所以不好从图上看出什么信息的。ESI的质谱图做了一级和二级,那你就利用MSMS做下数据库检索,看能匹配到你的蛋白不。
我的MALDI和LC-MS/MS都是在外面做的,如果把条带切下来酶解,再做LC-MSMS可能也得不少银子吧 呵呵 我会马上试着按你说的用数据库检索的 多谢你的建议 短短两句话就能感觉到你的思维好有调理性 很佩服啊
另,恳请高人不知可否往我邮箱或qq留个联系方式给我 还有序列检索的一些问题想请教你 真的非常感谢啊
从MALDI上来看 酶解的片段还是挺长的,要鉴定其准确的序列具有一定的难度,不知道你用的是什么酶? 我说点我自己的看法:1.我看的要解的是活性部分的序列,这当然最好要将活性的的单体纯化至90%以上再进行序列的鉴定。在质谱上你虽然看到几个分子离子峰,但其实你并不知道活性的是哪一个! 2.将活性的成分纯化出来后,再像楼上那位同学说的做酶解,搜库的方法,但是这里要提醒你一下:搜库的方法是基于你的样品在数据库里面有的蛋白序列,否则你是鉴定不出来的!若搜不出什么蛋白,那你的活性蛋白就是新的蛋白,好好鉴定吧,可以为全世界的蛋白库做一点小贡献,呵呵! 在这里想说一句,要鉴定一个未知的蛋白或多肽的准确序列,不花点时间是很难测出来滴!
我的蛋白是已知序列的现在正想办法纯化 但是苦于得到做MALDI的产物已经只有微微20、30mg 不知道后续该如何纯化了 另外请教搜库的方法 具体用哪个库呢 我只知道大家都用Swiss-Prot 但是这个软件功能太强大具体用里面的小库来查呢 还请多多指教!
mascot的链接:/search_form_select.html
其中MS/MS Ion Search 是用二级质谱搜索的
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